pGEX-4T-3-pMD19-T-S11原核表达载体的构建表达与纯化及多克隆抗体的制备

pGEX-4T-3-pMD19-T-S11原核表达载体的构建、表达与纯化及多克隆抗体的制备水生呼肠孤病毒是水域生态环境中广泛存在的一类病毒，其中草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)是在1991年被国际病毒分类委员会(ICTV)分到水生呼肠孤病毒属，是由中国分离鉴定的第一株鱼类病毒[1]。GCRV是具有双层衣壳、无囊膜、立体对称的20面体球形颗粒，主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量以糖蛋白的形式存在的糖类，不含脂类[2]。草鱼自古以来就是中国池塘养殖的当家品种，而GCRV被认为是水生病毒中对草鱼毒力最强、致病死亡率最高的病毒之一，该病毒引起的出血病不仅直接危害鱼体，而且会激发细菌性“三病”的发生，使草鱼的成活率降低到40~50[3]，甚至只有10%左右[4]，给中国的草鱼养殖业造成了很大的危害和困扰。草鱼病毒性出血病，主要侵染于草鱼心脏、肝脏、肾脏、肌肉、脾、鳃、肠道等组织，且化学药物很难达到治疗效果，为了给草鱼养殖增产和减小不必要的经济损失，找到有效防治GCRV的方法显得尤为重要。GCRV基因组含有11条双链RNA(dsRNA)，其分段基因组RNA的3'端不含poly(A)尾巴,在5’和3’末端各含有特异的重复保守序列，为5’-GUUAUU和3’-UCAUC。11个片段根据凝胶电泳迁移率可分为3组，即大片段(L1,L2,L3)、中等片断(M4,M5,M6)、较小片段(S7,S8,S9,S10,S11)。GCRV共编码5种非结构蛋白,分别是NS16、NS26、NS31、NS38、NS80[5]。病毒的非结构蛋白在病毒的复制过程中发挥重要作用。其中NS26是由S11编码的，含有244个氨基酸残基，分子量为26.4KD,是水生呼肠孤病毒特有的蛋白质,没有同源蛋白，含ATP-依赖性的RNA解螺旋酶功能性位点[6]。国际上对GCRV编码蛋白的功能(尤其是非结构蛋白的功能)方面的研究还不够系统和全面；但根据呼肠孤病毒家族中同源蛋白功能相似的原则，除非结构蛋白NS26外，GCRV各蛋白在病毒复制周期中的地位和作用已经初步明确[7]。因此，研究S11表达的非结构蛋白NS26的免疫原性，并对其多克隆抗体进行分析，以期为今后研制草鱼亚单位疫苗做好坚实铺垫。课题组从草鱼养殖场患出血病的病鱼体中分离到一株具强致病力的病毒株，命名为GCRV-GD108[8]。本研究采用基因工程的方法，从感染GCRV-GD108的草鱼肾脏细胞CIK中提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用PCR扩增了S11基因，通过TA克隆连接至载体pMD-19-T中，构建了重组载体pMD-19-T-S11，再将重组载体pMD-19-T-S11双酶切连接至表达载体pGEX-4T-3，构建了重组表达质粒，酶切、测序鉴定获得重组质粒。将重组质粒在大肠杆菌BL-21中进行高效表达，用IPTG诱导获得了可溶性重组蛋白，采用GST亲和层析和凝胶过滤层析的方法对重组蛋白进行纯化，获得融合蛋白，利用SDS-PAGE及Westernblotting检验融合蛋白。采用纯化后的含有GST的融合蛋白免疫日本长耳大白兔制备多克隆抗体，ELISA法测定血清抗体的效价。1.1实验材科与实验仪器1.1.1菌株、质粒和细胞草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108，感受态细菌DH5α和BL-21，原核表达载体pGEX-4T-3和pMD-19-T，草鱼肾脏细胞（CIK）为本实验室保存。1.1.2实验试剂DNA限制性内切(BamHI和XhoⅠ)，TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、DNAFragmentPurificationKit，DNAMarker和AgaroseGelDNAPurificationKit，低分子量蛋白Marker和异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG)购自大连TaKaRa生物工程有限公司。TurboScript逆转录第一链cDNA合成试剂盒购自北京原平皓生物技术有限公司；GSTrap亲和柱购于GEHealthcare公司；还原型谷胱甘肽为Merck公司分装；PCR引物合成和重组质粒的测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal)、过硫酸铵、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)、溴化乙啶(EB)、二硫苏糖醇(DTT)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。一抗anti-GST,HRP一羊抗兔IgG酶标二抗均购于天根生物科技有限公司。琼脂粉，酵母提取物和胰蛋白胨购自于Oxoid公司。溴酚蓝、考马斯亮蓝G-250购买于鼎国生物技术有限公司。其余试剂氯化钠、氢氧化钠、氯化钙、冰醋酸、甲醇、乙醇等均为国产分析纯。1.2.1细胞总RNA的提取和cDNA的合成1.2.1.1细胞总RNA的提取参照细胞总RNA的提取方法，采用TRIzol法从CIK细胞中提取总RNA具体步骤如下:(一)试剂准备TRIzol试剂，氯仿，异丙醇，由DEPC水配制的75%乙醇，DEPC水。(二)操作步骤(1)六孔板培养的处于对数期的细胞，每孔细胞中加入1mlTrizol，冰上放置5min，枪头轻轻吹打。(2)将每孔中的裂解液收集到1.5mlEP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力震荡30s，30℃孵育2-3min，离心(4℃，12000g，15min)。(3)离心后，液体分三层(上层为无色水样层为RNA，中层为白色为DNA和底层为红色为蛋白质)，小心吸取上层无色液体移入新的EP管中。(4)在新的EP管中加入等体积的异丙醇，混匀，30℃孵育30min，离心(4℃，12000g,10rnin)。(5)去上清，沉淀中加入1ml75%的乙醇，漩涡振荡30s，离心(4℃,8000rpm，5min)。(6)去上清，管内沉淀室温干燥3-5minx(7)加入20μLDEPC水溶解，小份分装，5μL/管，-80℃冰箱保存。(三)注意事项(1)样品量和Trizol的加入量一定要按一定比例，不能随意增加Trizol量或减少样品量，否则会使内源性RNase不完全抑制，导致RNA降解。(2)实验过程必须防止RNsae的污染。1.2.1.2反转录合成cDNA整个操作过程需戴手套，严防RNase污染；RT反应中，先加入RNA模板2μgOligo(dT)15、1μLRNase-freeH2O定容至10μL，在70℃孵育5min，然后迅速置于冰上5min。然后顺次加入M-MLV5XBuffer4μL,dNTPs(10mM)1μL、RNaseInhibitor0.5μL、M-MLVRT1μL、RNase-freeH2O3.5μL，经37℃反应1h。75℃孵育15min终止反应，-20℃保存用于下游实验。1.2.1.3PCR扩增取反转录产物cDNA1μL作为PCR反应体系模板依次加入:10XTaqBuffer2.5μL,DNA模板1μL,dNTPs(10mM)1μL、上游引物(25pmoL/μL)0.5μL、下游引物(25pmoL/μL)0.5μL,Taq酶1μL，三蒸水定容至25μL。混匀后放入PCR仪，反应程序为:95℃预变性3min;其中94℃变性，54℃退火，72℃延伸分别进行45s;设置35个循环，最后72℃延伸5min。电泳分析扩增结果。1.2.1.4PCR产物与pMD19-T载体的连接在微量Eppendorf中加入pMDTM19-TVectorx1.1μL,4.5μL回收的目的DNA,5μL(等量)的SolutionI;充分混匀后16℃过夜培养。全量(10μL)加入至100μLDH5α感受态细胞中。在含有X-Gal,IPTG,Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。挑选白色菌落，并送上海生物工程公司测序，将测序正确的阳性克隆子命名为pMD19-T-S11保存备用。1.2.2pGEX-4T-3-pMD19-T-S11重组表达载体的构建以pMDTM19-T为模板，加入NS26特异性引物，PremixTaq12.5μL，加水至总体积25μL。扩增条件:94℃预变性5min后进入循环;94℃30s，60℃30s，72℃1min，循环30次;72℃延长10min。将该PCR产物割胶回收后用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收酶切片段，并与同样酶切处理的pMDTM19-T质粒进行16℃过夜连接，连接产物转化E.coliBL21感受态细胞，LA平板筛选阳性转化子，PCR鉴定后挑单菌落培养，提取质粒，双酶切鉴定后送上海生物工程公司进行测序。1.2.3pGEX-4T-3-pMD19-T-S11特异性肽段融合蛋白的表达与纯化将测序正确的质粒转化E.coliBL21感受态细胞，从氨苄LB固体培养基平板上挑取经酶切鉴定正确的单克隆菌落，扩大菌体培养，将过夜培养的菌液1mL加入新鲜配制含有100μg/mL氨苄LB液体培养基100mL中，在37℃180rpm的条件下振荡培养，直至OD600=0.8，吸取2mL未诱导的培养物样品，作为对照，将剩余的培养物分为5组，加入终浓度分别为0mmol/L的IPTG；0.1mmol/L的IPTG；0.2mmol/L的IPTG;0.4mmol/L的IPTG；0.8mmol/L的IPTG，继续在37℃180rpm的条件下振荡培养4h，离心收集菌体，超声破碎，SDS-PAGE检测蛋白表达情况。为了大量表达和纯化重组蛋白，将过夜培养的细菌，按照1:200的比例接种到400mLLB液体培养基中，培养基含氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL，在37℃，180rpm的条件下，振荡培养，直至OD600=0.6~0.8。在培养物中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG,37℃180rpm培养4h，然后在4℃，8000rpm离心10min收集菌体。按照每克菌体加入10mL柱平衡缓冲液(1mmol/LPMSF，500mmol/LNaCl,50mmol/LTris-HCl,pH8.0)的比例，加入柱平衡缓冲液，充分悬浮菌体，在冰浴条件下超声波破碎菌体(300w，工作5s，间歇3s)，然后12000rpm，4℃离心10min，分离上清和沉淀。将上清加至预先处理好的GST亲和层析柱中，并用平衡缓冲液冲洗10个柱体积，最后用10mM谷胱甘肽洗脱液洗脱，收集洗脱液，使用SDS-PAGE检测。采用超滤法(Millipore，截留蛋白质分子量为3000道尔顿)对纯化后的蛋白进行浓缩，浓缩后的样品使Superdex75凝胶过滤层析柱进一步纯化，通过280nm处的光吸收值进行检测，收集各组分，SDS-PAGE检测。蛋白浓度采用BCA法测定。1.2.4表达产物的Westernblotting分析纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE分离后，转移至硝酸纤维素薄膜(电流强度450mA，温度0℃)，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液4℃封闭过夜，PBS,0.1%吐温20洗涤3次，然后加入一抗(anti-GST，稀释比例1:100)37℃结合1h，PBS,0.1%吐温20洗涤3次，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(1:5000稀释)在37℃结合1h,PBS,0.1%吐温20洗涤3次，最后加入DAB显色30min，干燥后扫描图像保存。1.2.5pGEX-4T-3-pMD19-T-S11特异性肽段融合蛋白多克隆抗体制备与纯化1.2.5.1动物免疫将雌性日木长耳大白兔先适应性喂养1周。动物免疫前先于一侧耳缘抽取2mL静脉血，4℃静置过夜，取血清作阴性对照。用2mL弗氏完全佐剂加GST融合抗原(剂量为300Lg,V(福氏完全佐剂)：V(蛋白溶液)=9:10)混合成油包水的乳剂，背部皮肤皮内注射，免疫日本长耳大白兔，每只日本长耳大白兔注射2-3点;第28天用弗氏不完全佐剂加融合抗原，同样剂量免疫日本长耳大白兔，免疫前，从耳缘静脉少量取血，用作阴性对照。每两周加强免疫1次，共免疫4次。1.2.5.2血清效价检侧第3次加强免疫后，耳缘静脉取血，采用间接ELISA法检测血清效价。具体步骤如下:(1)将纯化好的融合蛋白溶于pH9.6的PBS缓冲