piRNA的生物合成及其在生殖细胞中的功能

piRNA的生物合成及其在生殖细胞中的功能CarlaKlattenhoffandWilliamTheurkauf*小干扰RNA和微小RNA是由双链的RNA前体经核酸内切酶Dicer切割生成的，并与Argonaute家族蛋白共同作用破坏转录物或沉默翻译。一类清楚的RNA核苷酸长度为24-30个，通过Dicer依赖型机制生产，与Argonaute蛋白家族中的Piwi蛋白结合。关于苍蝇、鱼和小鼠的研究暗示了Piwi蛋白结合RNAs（piRNA）在生殖细胞发育、沉默自私DNA元件和维持种系DNA完整性中的功能。然而，无论是piRNA染色质主要控制机制、基因转录、RNA稳定性或RNA翻译，还是piRNA的生物合成都不是很清楚。在这里，我们回顾了近期的关于piRNA生成和功能的研究，并讨论关于这个耐人寻味的新型小RNA的悬而未决的问题。前言1993年，安布罗斯和他的同事发现，线虫的lin-4基因通过负调控编码一个小调控RNA并与lin-14的转录单元互补（Lee等人，1993）。这些开创性的研究确定了第一个微小RNA（miRNA）。在动物和植物实验室中，非编码的小RNA随后成为强大的实验工具和关键的发育调节者（Baulcombe，2004；汉农，2002；Kloosterman和Plasterk，2006；梅洛和康特，2004）。目前，21个核苷酸（nt）的小干扰RNAs（siRNAs）被频繁用于实验性的操纵基因表达，它是通过Dicer核酸内切酶处理长双链RNA（dsRNA）的前体得到的，随后形成中间体RNA-蛋白质复合体。该中间体取代RNA的其中一条链（被称为“过客链”），并产生成熟的RNA诱导的沉默复合体（RISC），其中包含一条能够与Argonaute蛋白家族结合的单链（“引导链”）。当siRNA的引导链与靶RNA完全互补时，Argonaute蛋白识别特异性序列并切割（Hannon，2002；Meister和Tuschl，2004）。在体内，siRNA途径会降低病毒生命周期中RNA中间体的产生，因此在限制病毒感染中起重要作用（Wang等，2006）。通过比较，miRNA是从由染色体基因编码的茎环转录物中衍生出来的。初级茎环RNA（priRNA）是在细胞核中由Drosha核糖核酸酶催化产生premiRNAs，然后从细胞核中出来并在细胞质中被Dicer酶内切酶催化裂解，从而生成22nt的成熟miRNA。这些miRNA与Argonaute蛋白结合并诱导靶基因活性的同源依赖性下调。miRNA与其目标转录物间的不完全碱基配对将会诱导翻译沉默，而完美的碱基配对将触发RNA破坏。在miRNA途径突变的突变体中，发育破坏并且经常导致胚胎致死（Du和Zamore，2005；Kloosterman和Plasterk，2006）。最近的研究发现了一类新的24-30nt的RNA，其由无Dicer依赖性机制催化，并产生能够与Argonaute蛋白家族中的Piwi蛋白结合（Aravin等，2006；Brennecke等，2007；Girard等，2006；Grivna等，2006；Gunawardane等，2007；Houwing等，2007；Lau等，2006；Saito等，2006；Vagin等，2006；Watanabe等，2006）。其对于雌雄果蝇生育能力是必不可少的（Lin和Spradling，1997）。在一些系统中，这些与Piwi蛋白相互作用的RNA（piRNA）主要是从转座子和其他重复序列元件中衍生而来的（Brennecke等，2007；Gunawardane等，2007年；Saito等，2006），从而导致它们曾定义为重复序列偶联的小干扰RNA（rasiRNAs）（Aravin等，2003）。现在已很清楚，piRNA即可以从重复序列也可以从复杂的DNA序列元素中衍生出来（Aravin等，2007；Brennecke等，2007；Houwing等，2007），并且piRNA包含rasiRNAs。因此，我们在下面的讨论中使用更通用的术语——piRNA。小鼠、果蝇和斑马鱼的遗传学研究表明，piRNA在种系发展中是至关重要的（Carmell等，2007；Chen等，2007；Cook等，2004；Cox等，1998；考克斯人，2000；Deng和Lin，2002；Gillespie和Berg，1995；Houwing等，2007；Kuramochi-Miyagawa，等，2004；Pane等，2007；Schupbach和Wieschaus，1991）。然而，参与piRNA合成的蛋白质揭示，其能够在体细胞中调控基因表达（Grimaud等，2006；Pal-Bhadra等，2002；Pal-Bhadra等，2004），以及影响学习和记忆（Ashraf等，2006），这表明piRNA可能对生物进程造成较广泛的影响。piRNA的合成piRNA的长度24-30nt表明，他们不由Dicer酶（切割双链前体产生21-22nt的产物）产生的（Bernstein等，2001）。最近的基因研究一致表明，piRNA是通过一个切酶非依赖性过程产生的（Houwing等，2007；Vagin等，2006年）。在果蝇中，从其基因组的起源和与Argonaute蛋白的结合研究中，能够洞察piRNA的合成机制（Aravin等，2006；Brennecke等，2007；Girard等，2006；Grivna等，2006年；Gunawardane等，2007；Houwing等，2007；Lau等，2006；Saito等，2006；Vagin等，2006）。在果蝇卵巢中，绝大多数piRNA来自于一定数量的近着丝粒和端粒，这些位点富含反转录转座子序列（Brennecke等，2007）。绝大多数piRNA是从反义链上的反转录转座子序列派生得到，并且这些RNA优先与Argonaute蛋白家族的Piwi蛋白和Aubergine蛋白（Aub）结合。相反，piRNA的正义链优先与Argonaute蛋白3（Ago3）结合（Brennecke等，2007；Gunawardane等，2007）。Piwi蛋白、Aub蛋白和Ago3蛋白，与piRNA形成复合体，可以切割靶RNA引导链在第10和11个碱基之间的位点（Gunawardane等，2007；Saito等，2006）。在果蝇中，从相反链获得的piRNA显然具有一个10nt的重叠。此外，反义piRNA与Piwi和Aub结合表明，其更倾向与结合在5’端有一个U残基的序列；而正义piRNA与Ago3结合是因为其序列往往在第10位有一个A残基（Brennecke等，2007；Gunawardane等，2007）。基于这些观察，这两个团队同时提出了piRNA合成的“乒乓”模型，其中Ago3与正义链piRNA结合并催化反义链，其在A:U碱基对处进行切割并产生具有5’端的反义piRNA（图1）（Brennecke等，2007；Gunawardane等，2007）。这个具有5’端的裂解产物拟与Aub或Piwi蛋白结合，在核酸水解处理3’端后，产生成熟的23-30nt的反义piRNA（图1B）。而后，成熟的反义piRNA-Argonaute复合物结合并切割RNA的正义链，沉默基因表达和产生的5’端的能与Ago3结合的正义piRNA前体（图1D）。3’端的成熟正义piRNA继续反应，完成循环（图1E）。该模型是基于在果蝇中的研究，但最近的研究结果表明，一个类似机制可能在小鼠中存在（Aravin等，2007）。图1，piRNA合成的乒乓球模型。（A）Argonaute家族蛋白中的Piwi蛋白类的Argonaute蛋白3（Ago3）与正义链piRNA（蓝色）结合，并指导靶反义链转录物（红色）的裂解，产生5'端反义链piRNA。（B）Aubergine（Aub）和Piwi蛋白（未示出）与所得到的piRNA前体结合，然后剪切形成piRNA的最终长度。这步骤可能是由假定的核酸酶Squash和Zucchini来催化。（C）果蝇的Hen1甲基化piRNA的3'端（3OME）。（D）Aub-反义链piRNA复合体催化正义转录物（蓝色）的裂解，产生5'端的正义piRNA。（E）Ago3与修剪的和（F）甲基化后的piRNA前体结合，即为反义链piRNA。根据Brennecke等人提出的模型（Brennecke等，2007）。在piRNA合成的“乒乓”模型中，调解一些拟议的步骤的蛋白质尚未确定，但最近的研究结果可能有助于填补其中的一些空白。例如，在果蝇中突变zucchini和squash的基因会扰乱piRNA的生产，并导致反转录转座子的损失沉默，而这两个基因都编码假定的核酸酶（Pane等，2007）。因此，zucchini和squash可切割3’端以产生成熟piRNA（图1）。此外，成熟piRNA的3’端被甲基化（Kirin和Mourelatos，2007；Ohara等，2007）。在果蝇中，该反应是由Hen1编码的RNA甲基转移酶（也称为DmHen1和Pimet）进行的，当piRNA与Argonautes蛋白结合后再甲基化（Horwich等，2007；Saito等，2007）。Hen1基因突变的果蝇突变体其piRNA的长度和稳态水平将减少，这表明甲基化限制3’端加工和增加了piRNA的稳定性（Horwich等，2007）。甲基化作用也可能影响了piRNA途径中piRNA与其余组分之间的相互作用。然而，果蝇hen1突变体是可行和可育，这表明该基因修饰对于piRNA功能不是必不可少的（Saito等，2007）。在果蝇中，遗传筛选已经确定了几个额外的对于piRNA合成或功能所必需的因素。例如，armitage和spindleE基因编码的假定解旋酶是piRNA合成和反转录转座子沉默所必需的（Aravin等，2004；Vagin等，2006）。在piRNA合成过程中，这些蛋白质可以展开双链中间体形态，识别靶基因，或者裂解。相反地，cutoff基因是反转录转座子沉默所必需的，但不是piRNA合成必需的（Chen等，2007）。酵母的同源Cutoff曾揭示了RNA衰变（Kim等，2004；Xue等，2000）。因此，通过增强piRNA-Argonaute蛋白复合物的活性，Cutoff可能有助于基因沉默。piRNA路径的条块分割近日，果蝇的Tudor结构域蛋白Krimper已经被证明与抑制逆转录转座子和piRNA基因的产生有关。这种蛋白质是类核周体的一个组成部分，即已经证实与RNA加工种系特异性核周结构和krimper蛋白突变阻断类核周体形成有关。有趣的是，许多与piRNA路径相关蛋白积聚在类核周体中，这是突变的滋卵细胞。果蝇卵母细胞是由带有15个与合成RNAs和蛋白有关的滋卵细胞通过环状管道运输至卵母细胞而形成。类核周体最初在电子显微照片确定为围绕滋卵细胞核非晶电子致密的云。在解旋酶和核酸酶作用下，类核周体中富集了Argonautes蛋白家族中的Piwi亚家族：Aub和AGO3。与大多数piRNA基因路径相关的蛋白，果蝇的Piwi几乎完全被滋卵细胞同化。这些观察表明，piRNA的产物和功能可能会被割裂开来。piRNA与Argonaute蛋白的复合物似乎在该途径中是具有催化活性的效应的，而这些定位研究表明的Piwi介导了核函数的piRNA的途径，Ago3和Aub驱动细胞质功能。根据对正义链与反义链Argonaute蛋白的复合物在类核周体的性质，我们推测出piRNA的生源论机制。在这个模型中，piRNA的前导转录物正义链被输出到类核周体，在那里它们被Aub-反义piRNA基因复合物裂解，沉默靶基因的表达和产生的有义链的piRNA前体。这些与Ago3相关的有义链前体被修剪到成熟的长度。Ago3-有义链复合物催化裂解反义链转录物，产生了与Aub和Piwi相关的piRNA前体。成熟的Aub复合物依然留在类核周体中发挥裂解正义链转录产物，促使piRNA合成的作用，而成熟的Piwi复合物则被运送至细胞核