TCID50与moi值的计算

实验四病毒感染力的滴定（TCID50的测定）一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50(50%lethaldose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg50%infectivedose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50%tissuecultureinfectivedose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100µl。3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TCID50的计算方法1、Reed-Muench两氏法病毒液稀释度出现CPE孔数无CPE孔数累计出现CPE孔所占的%CPE孔数无CPE孔数10-180270100（27/27）10-280190100（19/19）10-37111191.6（11/12）10-4354640（4/10）10-5171130.7（1/14）10-6080210（0/21）CPE：Cytopathiceffect距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。2、Karber法病毒液稀释度出现CPE的孔数出现CPE孔的比率10-188/8=110-288/8=110-377/8=0.87510-433/8=0.37510-511/8=0.12510-600/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。什么是MOI？MOI是multiplicityofinfection的缩写，中文译为感染复数。传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfunumber/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如腺病毒、单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。而对于某些病毒如AAV病毒，无法用pfu表示病毒的数量，而是采用TU、IU、病毒颗粒（viralparticles,v.p）或基因组数量（vectorgenome,v.g.）来表示病毒数量，因此其MOI就有了不同含义。采用TU或IU，MOI的含义便是TUnumber/cell或IUnumber/cell。采用v.p.，MOI的含义便是v.p.number/cell。采用v.g，MOI的含义便是v.g.number/cell。可以将上述不同的MOI表示方式分为2种：1）以活性单位表示病毒数量，如pfu,TU,IU。这时MOI的含义是指平均每个细胞感染病毒的活性单位数。2）以病毒颗粒或基因组数表示病毒数量，如v.p.或v.g.。这时MOI的含义是指平均每个细胞感染病毒的病毒颗粒或基因组数。值得一提的是，上述2种不同的MOI表示方式在含义和数值上都有所不同。前一种是传统意义上的MOI，后一种MOI表示方式的含义更为简化和直观，也逐步被一些研究者采用。传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。其公式为：P(k)=1-P(0),P(0)=e-m或m=-InP（0）。其中：P(k)为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则：P(0)=1%=0.01m=-In(0.01)=4.6pfu/cell。由此可以看出，由于病毒特性和研究者习惯的不同，MOI的单位由原来约定俗成的pfunumber/cell变成多种表示单位。在阅读文献和写作论文时，应注意MOI的具体含义和单位。MOI=（pfu/ml的值）乘（取的病毒液体积）再除以你要转染的细胞数。TCID50与PFU换算:PFUs＝0.7×TCID50的滴度PFU:plaqueformingunit，空斑形成单位。感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。因此建议也可使用TCID50法。Sampleproblem:Youinfectamonolayerof1X107cellswith0.1ml.ofasampleofvirusthetiterofwhichis1X109PFU/ml.WhatistheMOIofthisinfection,andhowmanycellsareinfected?0.1ml.(1X109PFU/ml)=1X108PFUMOI=PFU/cell=1X108/1X107=10Theproportionofinfectedcells=1-theproportionofuninfectedcells=1-e-m=1-e-10=0.999952Thenumberofinfectedcells=thetotalnumberofcellsmultipliedbytheproportionofinfectedcells=(1X107)(0.999952)=0.999952X107.ThusatanMOIof10,mostcellsareinfected.Nowyoucalculatethenumberofcellsthatareuninfected,infectedwithonePFU,andmultiplyinfected.TheOne-stepgrowthcurvewasdevisedbyEllisandDelbrucktostudythesinglecelllifecycleofbacteriophage.Thekeyelementofthisexperimentissynchronizationoftheinfectedcellssothatthepopulationreflectseventsoccurringinthesinglecells.SynchronizationisachievedbyinfectingthecultureofcellsatanMOIatwhichmostofthecellsareinfected(MOIof5-10).AtvarioustimesaliquotsoftheinfectedculturearewithdrawnandassayedforPFUbyplaqueassay.Samplescanbetittereddirectly,orlysedpriortoanalysistoobserveintracellularevents.Refertoyourtextforagraphicplotofthecurves.Payspecialattentiontotheeventsinthelifecycleofavirus(eg.Adsorption,uncoating,biosynthesis,assemble,release)thatoccurinthelatent,eclipse,exponentialrise,andplateauregionsofthecurve.Fromthetotalnumberofcellsintheculture,andthetotalnumberofprogenyPFUproducedattheendoftherise(“burst”)onecancalculatethenumberofPFUproducedpercell.------------------------------------------------------MOI,pfu,andTCID50Plaqueformingunits(pfu)isameasureofnumberofinfectiousvirusparticles.Itisdeterminedbyplaqueformingassay.Multiplicityofinfection(moi)istheaveragenumberofvirusparticlesinfectingeachcell.TCID50isthetissuecultureinfectiousdosewhichwillinfect50%ifthecellmonolayerschallengedwiththedefinedinoculum.Ifthetiteris103TCID50/0.2ml,MK,2days,itmeansthatwhena0.2mlinoculumofa1:1,000dilutionofthevirusisaddedtoeachoffourtubescontainingmonkeykidney(MK)cells,twotubesareexpectedtobecomeinfected.MOIisrelatedtopfubythefollowingformula:Multiplicityofinfection(moi)=Plaqueformingunits(pfu)ofvirususedforinfection/numberofcells.Forexample,if2x106cellsisinfectedby50mlofviruswithatiterof108pfu/ml.Themoiwillbe0.05*108/2*106=2.5.ThefractionofcellsthatarenotinfectedisP(0)=1-e-moi,i.e.,8%formoi=2.5.Toensure99%ofcellsareinfectedrequiresmoi4.6.AssumetheconditionsusedforplaqueassayandTCIDassaydon'taltertheexpressionofinfectiousvirus,TCID50/mlandpfu/mlarerelatedbypfu/ml=0.7*TCID50.Asaworkingestimate,onecanusepfu/ml=0.5*TCID50.H5N1流感病毒TCID50（组织半数感染量）测定一生物材料与试剂1.病毒与细胞高致病性H5N1禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/35/2011（以下简称：YZ35）MDCK细胞2.培养基10%DMEM、无血无抗DMEM、1%DMEM3.其他96孔板、血凝板、PBS、1%的鸡红细胞二操作步骤1.细胞准备取出一块96孔细胞培养板，每