PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死

中国组织工程研究第20卷第23期2016–06–03出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJune3,2016Vol.20,No.23P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·徐慧敏，女，1980年生，河南省商水县人，汉族，2004年郑州大学医学院毕业，主治医师，主要从事老年心脑血管疾病方面的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)23-03400-07稿件接受：2016-04-20PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死徐慧敏，刘玉茹，万琪琳，李彦明，吴昌维(河南大学淮河医院老年病科，河南省开封市475000)引用本文：徐慧敏，刘玉茹，万琪琳，李彦明，吴昌维.PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死[J].中国组织工程研究，2016，20(23):3400-3406.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.008ORCID:0000-0002-4913-489X(徐慧敏)文章快速阅读：文题释义：基因沉默：双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。PTEN基因：是迄今发现的第一个具有特异性磷酸酶活性的抑癌基因，该基因的突变失活与人类多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，在细胞的生长发育、信号转导和细胞凋亡中起着重要作用。摘要背景：骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死是近年来的研究热点，但是心肌梗死区域的缺血缺氧微环境和早期炎症反应不利于移植细胞的存活，影响治疗效果。目的：探讨PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的效果。方法：①SD大鼠骨髓间充质干细胞随机分为3组，空白对照组不进行任何处理，阴性对照组用Lipofectamin2000转染无意义的NCsiRNA，RNAi组用Lipofectamin2000转染PTEN基因特异的siRNA。采用MTT法描绘细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期；②取30只SD大鼠建立心肌梗死模型，随机分为3组，每组10只，分别为空白对照组、阴性对照组、RNAi组。建模6h后，使用微量注射器和立体定位仪在左心室前壁梗死区中心注射相应的骨髓间充质干细胞，治疗后4周进行超声心功能检测，采用荧光显微镜观察细胞的存活和增殖情况。结果与结论：①RNAi组骨髓间充质干细胞在培养各时间点的吸光度值均显著大于空白对照组和阴性对照组；②RNAi组S+G2期细胞占总数的比例显著大于空白对照组和阴性对照组(P0.05)；③RNAi组大鼠心肌组织中骨髓间充质细胞数量显著多于空白对照组和阴性对照组(P0.05)；④治疗4周，RNAi组的左心室射血分数、左心室短轴缩短率显著小于空白对照组和阴性对照组(P0.05)；⑤体外实验表明PTEN基因沉默能有效地促进骨髓间充质干细胞的增殖，抑制细胞凋亡；⑥体内实验表明PTEN基因沉默的骨髓间充质干细胞在心肌梗死区域更易存活和扩增，心功能改善明显。关键词：干细胞；移植；急性心肌梗死；第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因；基因沉默；骨髓间充质干细胞；干细胞移植主题词：心肌梗塞；PTEN磷酸水解酶；骨髓；间质干细胞；基因沉默；组织工程PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死大鼠SD大鼠骨髓间充质干细胞用Lipofectamin2000转染PTEN基因特异的siRNA细胞增殖加快，细胞凋亡减少植入心肌梗死模型SD大鼠心肌组织内存活细胞增多，心功能改善明显徐慧敏，等.PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH3401(DepartmentofGeriatrics,HuaiheHospitalofHenanUniversity,Kaifeng475000,HenanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Bonemarrowmesenchymalstemcelltransplantationformyocardialinfarctionbecomespopularizedinrecentyears,buttransplantedcellscannotsurviveandproliferateunderearlyinflammatoryreactionorlocalischemia/hypoxiamicroenvironment,eventuallyhamperingthetherapeuticoutcomes.OBJECTIVE:ToinvestigatethetherapeuticeffectofPTEN-silencedbonemarrowmesenchymalstemcellsonacutemyocardialinfarction.METHODS:(1)BonemarrowmesenchymalstemcellsfromSprague-Dawleyratswererandomlyassignedtoreceivenotreatment,NCsiRNAtransfectionusingLipofectamin2000orPTENsiRNAtransfectionusingLipofectamin2000.CellgrowthcurvesweredescribedusingMTTmethodtodetectcellcycleusingflowcytometry.(2)ThirtySprague-Dawleyratswereselectedtopreparemyocardialinfarctionmodelsthatwererandomizedintothreegroups(n=10pergroup):blankcontrol,negativecontrolandRNAigroup.Sixhoursaftermodeling,bonemarrowmesenchymalstemcellstransfectedwithnothing,NCsiRNAandPTENsiRNAwererespectivelyinjectedintotheinfarctedcenteroftheleftventricularanteriorwallinthesethreeratgroups.After4weeks,allratsweresubjectedtocardiacfunctiondetectionusingechocardiography,andthesurvivalandproliferationofbonemarrowmesenchymalstemcellsintheratswereobservedbyfluorescencemicroscopy.RESULTSANDCONCLUSION:Comparedwiththeothertwogroups,asignificantincreaseintheabsorbancevaluesatdifferentculturetime,theproportionofcellsinS+G2phase,andthenumberofbonemarrowmesenchymalstemcellsinthemyocardialtissuewasfoundintheRNAigroup(allP0.05).Additionally,theleftventricularejectionfractionandleftventricularshorteningfractionweresignificantlyreducedintheRNAigroupthantheblankcontrolandnegativecontrolgroupsat4weeksaftercelltransplantation(P0.05).BothinvivoandinvitroexperimentalfindingsshowedthatPTENsilencingcouldeffectivelyimprovecellsurvivalandproliferationintheinfarctedmyocardium.Moreover,intheinvivoexperiment,anovertimprovementinrat’scardiacfunctionwasachieved.Subjectheadings:MyocardialInfarction;PTENPhosphohydrolase;BoneMarrow;MesenchymalStemCells;GeneSilencing;TissueEngineeringCitethisarticle:XuHM,LiuYR,WanQL,LiYM,WuCW.PTEN-silencedbonemarrowmesenchymalstemcelltransplantationforacutemyocardialinfarction.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(23):3400-3406.0引言Introduction急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，是一种致命性疾病，其发病率呈不断上升趋势[1]。目前临床治疗心肌梗死的方法主要有药物治疗、手术治疗、介入治疗等，但是上述方法不能修复或逆转已坏死的心肌，无法获得理想的效果。随着干细胞理论和技术的不断发展，各种类型干细胞开始应用于治疗心肌梗死[2]。研究表明，骨髓间充质干细胞移植后能够分化为心肌细胞替代受损的心肌细胞，同时还能分化为血管内皮细胞，促进心肌梗死区域的血管再生，是目前心肌梗死治疗研究的热点[3]，但是仍然有许多问题有待解决，其中心肌梗死区域的缺血缺氧微环境和早期炎症反应不利于移植细胞的存活[4-6]。为提高骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的效果，需要通过有效的方式对细胞进行处理，以提高其生物学性能。PTEN基因是具有特异性磷酸酶活性的抑癌基因，能有效抑制肿瘤细胞的生长，还可以通过抑制Akt途径而使Bcl-2蛋白表达减少，从而促进细胞凋亡[7-8]。为此，实验选择PTEN基因沉默方式对骨髓间充质干细胞进行处理，探讨PTEN基因沉默对骨髓间充质干细胞生物学性能的影响，及其移植治疗急性心肌梗死的效果。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞学体外观察，随机对照动物实验。1.2时间及地点实验于2015年10至12月在河南大学淮河医院实验室完成。1.3材料雄性SD大鼠30只，2月龄，体质量180-270g，由上海義森生物科技有限公司提供。SD大鼠骨髓间充质干细胞株由上海信裕生物技术有限公司提供。徐慧敏，等.PTEN基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死P.O.Box10002,Shenyang110180大鼠骨髓间充质干细胞培养将骨髓间充质干细胞株从液氮中取出，放入水浴锅中，轻轻摇动让细胞快速溶解，用吸管将冻存管中的细胞悬液移至加入DMEM培养液的离心管