qPCR样本处理--------人外周血淋巴细胞RNA的提取方法

人外周血淋巴细胞RNA的提取方法一、采集血样，室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为1ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。二、提取淋巴细胞。取1.5ml无菌无酶的离心管，为管1，先加入500ul淋巴细胞分离液；另一个1.5ml无菌无酶的离心管中，装有500ul血样的真空管和500ulPBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀的混合物，共1ml。然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的管1中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。1500rpm,15min,20摄氏度。说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。3、转数为1500rpm，时间范围为15分钟，温度为室温20摄氏度。推荐两步离心法：首先用1500rpm/min离心15min，如果白膜层足够一步就结束，如果发觉细胞不够，说明该病人的淋巴细胞比重较低，再重新用1500rpm/min离心15min。三、离心后，分四层。淋巴细胞位于第二层（从上到下），呈白蒙蒙的一薄层。用移液器（200ul档）吸取分离液层中的淋巴细胞，这里技巧性比较强，需要多次练习才能比较熟练的把淋巴细胞吸的比较完全，大约可得到400ul的液体。把吸取的淋巴细胞溶液装入另一无菌离心管中。加入1mlPBS缓冲液到离心管中，1500r,15min，20摄氏度。把离心后的上层液体倒掉，重复离心步骤至液体无明显红色（即红细胞数量很少），淋巴细胞位于离心管底的一小点白色的物质，一般会混有少量红细胞，尽量避免。说明：1、洗涤后离心的条件，通常用1500rpm就足够了，太高了容易把细胞离死。时间为15min，温度还是室温20摄氏度。2、离心后，看到淋巴细胞中混有少量红细胞，在这个实验中问题不大。3、洗涤液的选择也是平衡盐溶液即可，作用主要是去除淋巴细胞中的血浆蛋白和血小板，红细胞很难去掉。一般洗涤液PBS用3ml即可。四、用Trizolreagent裂解淋巴细胞，提取RNA。在离心管中加入1mlTrizol试剂，可以裂解除RNA以外的其他大分子物质，细胞膜，细胞器等。这个东西有致癌、致畸性，要带口罩，小心操作。用加液枪吹打离心管底部的淋巴细胞团块，把其打散。一般至少吹打30-60次，主要目的是把其打散，让Trizol试剂充分裂解淋巴细胞。把吹打之后的液体转移到冻存管中，标记，浸泡进液氮（这一步的目的是快速冻存mRNA），一到两小时以后，转存在-80摄氏度冰箱中。五、外送说明：1、TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。2、在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5MNaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。当TRIZOL用量少于2-ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。3、最后用于装裂解细胞的冻存管请购买无菌无酶的冻存管。BioTNT相关产品：1、淋巴细胞分离液，200ml，130元；2、10×PBS,250ml，BioTNT，60元；3、Trizol，100ml，invitrogen，1600元；（BioTNT提供分装产品，400元/20ml）4、1.5ml冻存管，无色可立，已灭菌，有盖，Axygen，100支/包，1355、无菌RNase-freeeppendorf管(1.5ml)，Axygen，1000支/包，91