RNA干扰及其应用

RNAi是NapoliCD等[1]在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因,用以增加其花色时发现的。结果出乎预料,转基因的植株不仅没有新基因的表达,反而自身的色素合成也减弱了,一些转基因的花出现了全白色或部分白色。他们把这种导入的基因未表达和植物本身合成色素基因的失活现象命名为共抑制(cosuppression)。之后,Ramano等在向粗糙孢菌(Neurosporacrassa)中导入合成胡萝卜素的基因时造成失活,他们称为基因静止(quelling)。GuoS等[2]发现正义RNA与反义RNA有相同水平的抑制效应，但未能就此现象给出合理的解释。FireA等[3]在研究反义核苷酸时发现在线虫体内,双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)能有效地抑制有互补序列的内源性基因,且抑制效果优于单链反义RNA。至此，正式提出了双链RNA诱导的RNAi的概念，开启了RNAi研究的序幕。1RNAi可能的作用机制及特点1.1RNAi的作用机制虽然RNAi作用的确切机制尚不清楚，但目前普遍认可是Bass假说。具体概括为三个阶段。（1）起始阶段。在细胞内,双链RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)Dicer在ATP的参与下被处理为21个～23个碱基的小RNA，即小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA是由19个～21个碱基配对形成的双链,并在其3′末端有两个游离未配对的核苷酸。研究发现,siRNA是RNAi作用发生的重要中间分子，序列与所作用的靶mRNA的序列具有高度同源性；双链的两端各有2个～3个突出的非配对的3′碱基；两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基。这些是细胞赖以区分真正的siRNA和其他双链RNA的结构基础。研究表明,平末端的siRNA或失去了5′磷酸基团的siRNA不具有RNAi的功能[4]（2）引发阶段。siRNA与Argonaute蛋白家族及其他未知因素结合，形成siRNA-核蛋白复合物（siRNA-ribonucleoproteincomplex，siRNP）。siRNP在ATP及其他未知因素参与下，使双链siRNA解旋形成RNA诱导的沉默复合物(RNAinducingsilencingComplex,RISC)。RISC可能以完全单链或两条链解旋但不完全分离的形式存在，继而RISC在dsRNA的介导作用下与互补mRNA结合，并将其降解。mRNA被降解在转录后水平,抑制基因表达,因而又称之为转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)（3）循环放大阶段。在siRNA诱导的RNAi过程中,可能还存在siRNA的循环放大过程,以维持它的RNA诱导功能。此过程推测是以siRNA为引物,互补mRNA为模板,在RNA依赖性RNA合成酶(RNA-dependentRNAPolymerase,RdRP)的作用下,合成新的双链RNA，再由Dicer作用,产生新的siRNA,完成siRNA的放大过程，开始新的RNAi循环[5]。关于对RNAi机制中重要酶的作用研究，ZamorePD等[6]发现，21ntRNA指导mRNA的降解；ScharfWD等[7]发现ATP依赖的RNA解旋酶为Mut6;GrishokA等[8]发现Let-7和lin-4为内源性的RNAi基因（stRNA）；DalmayT等[9]提出RNA依赖的RNA多聚酶就是SDE-1；BernsteinE等[10]证实RNaseш样的核酸酶为Dicer;ElbashirSM等[11]应用外源性21nt-siRNA能够抑制同源mRNA的表达;NovinaCD等[12]证实无论是针对病毒感染细胞所需的CD4受体，还是针对病毒基因组的gag区域，siRNA都可以有效地使病毒与细胞的基因沉默，抑制HIV的感染与复制。1.2RNAi的作用特点(1)“共抑制”性。RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默机制,它的启动子相当活跃,外源基因可以转录,但不能正常积累mRNA；RNAi作用不仅使外源基因在转录后水平上失活,同时诱导与其同源的内源基因沉默。(2)高效性。试验证明双链RNA干扰mRNA翻译的效率比单纯反义或正义RNA的抑制效率提高了几个数量级；RNAi可在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使靶基因表达降到很低水平甚至完全“剔除”,而产生缺失突变体表型。它比基因敲除技术更为便捷,科学家称RNAi技术为靶基因或靶蛋白的“剔降”(knockdown)。(3)高特异性。由dsRNA降解成的小干扰RNA,除其正义链3′端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外,其余碱基在序列识别中都是必需的,单个碱基的改变即可使RNAi失效,RNAi能特异性降解mRNA,针对同源基因共有序列的RNAi则可使同源基因全部失活。(4)高穿透性。RNAi具有很强的穿透能力,能在不同的细胞间长距离传递和维持，如在含有双链RNA的溶液中,喂食表达双链RNA的细菌等，能向秀丽隐杆线虫导入双链RNA。(5)“遗传性”。已在线虫中观察到RNAi效应通过生殖系传递到后代,说明RNAi具有一定的可遗传性。高稳定性。细胞中可能存在天然的稳定siRNA的机制。此机制可能是siRNA与某种保护性蛋白结合,从而使其具有相对的稳定性,这些双链RNA不像反义核酸那样需要多种化学修饰来提高其半衰期。(7)双干扰系统。哺乳动物中存在有非特异性干扰和特异性干扰两条独立的途径。非特异性干扰反应是由大于30个碱基对的双链RNA介导,导致整个细胞中非特异性蛋白合成抑制,RNA降解；特异性反应由21bp～25bp的小干扰RNA介导,可逃避非特异性干扰系统的“监控”,只降解与其序列相应的单个基因的mRNA[11]。2研究方法在研究过程中，科研人员逐渐摸索总结出了成套的研究方法。目前，展开RNAi操作主要有两种方法。一种为直接将靶向特定基因的大约21个碱基长短siRNA，或45个~50个碱基的发夹结构RNA（smallhairpinRNA，shRNA）转染到细胞，shRNA在细胞中会自动被加工成siRNA，从而引发基因沉默或表达抑制。另一种为构建特定的siRNA表达载体，通过质粒在体内表达siRNA而引发基因沉默。此法的优点是排除了RNA酶干扰，延长siRNA半衰期。更重要的是，该法可以进行稳定表达细胞株的筛选，且随着质粒复制扩散到整个机体，基因抑制效果可传代。试验表明，可被化学合成或体外合成的siRNA抑制的基因同样可被表达相同序列的载体表达出的siRNA所抑制。3RNAi的应用3.1基因功能研究在神经生物学研究中，科学家们通过siRNA表达质粒对中脑腹侧神经细胞中的多巴胺能相关基因进行了有效抑制，还通过病毒介导的RNAi建立了此类成年小鼠模型，不仅为建立神经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记，对神经系统的基因治疗也有一定借鉴意义；在癌症研究中，通过shRNA表达载体成功抑制成年大鼠脑癌基因，同时对RNAi的远程（穿过血脑屏障）基因沉默方法进行了非常有益的探索；利用细胞凋亡途径，通过RNAi抑制凋亡基因Caspase-8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率，并发现Caspase8siRNA处理对特异性Fas激活剂（Jo2和AdFasL）和野生型腺病毒介导的急性肝功能衰竭都有效，表明这个动物模型能反应人类急性病毒肝炎多分子参与的机制，增强了siRNA用于急性肝炎病人治疗的希望。除了对某些关键基因的RNAi研究外，还在哺乳动物细胞中探索了siRNA在基因组水平上的筛选方法。他们建立了一个包含8000多个基因的siRNA表达框文库阵列，通过它来高通量筛选NF-kB信号途径中已知的及Unique基因。由此可见，RNA干扰也正作为筛选成百甚至上千基因的工具，发挥着越来越大的作用[13]。RNAi为系统地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径。通过在一段时间内对一个基因RNA信号的抑制，研究者可以深入研究基因功能，进而描绘支配从细胞形态到信号系统的遗传网络。3.2基因治疗及药物筛选探索由于RNAi是针对转录后阶段的基因沉默，相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除，整个流程设计更简便，且作用迅速，效果明显，为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制，控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。尤其针对引起一些对人类健康严重危害的病毒，如2003年在全球多个国家和地区流行的SARS，病原体是单链核酸的新型冠状病毒，寻找药物靶点，设计核酸药物就更为方便。目前已经有很多公司在积极开发这方面的药物，如在SARS药物研究中一鸣惊人的美国俄勒冈州的AVIBioPharma生物制药公司等。国内也有很多研究机构及生物技术公司投入了这方面的工作。如上海生科院成立了SARS防治科研攻关小组，其中生化细胞所和药物所的一些课题组在从RNAi的角度努力。此外，北京大学、中南大学，北京动物所等大专院校和研究机构，以及北京金赛狮反义核酸技术开发有限公司等，也开展了RNAi药物的研究与开发。基因治疗方面最引人注目的进展之一是对肝炎病毒的RNAi研究。MccaffreyAP等通过表达shRNA的载体在细胞水平和转染HBV质粒后免疫活性缺失的小鼠肝脏中成功抑制了HBV复制。与对照相比，小鼠血清中测得的HBsAg下降了84.5％，免疫组化对HBcAg的分析结果下降率更超过99%。哈佛大学Lieberman研究小组通过注射针对Fas的siRNA，过度激活炎症反应，诱导小鼠肝细胞自身混乱。然后给测试小鼠注入Fashyperdrive的抗体，发现未进行siRNA处理的对照组小鼠在几天中死于急性肝功能衰竭，而82%的siRNA处理小鼠都存活下来，其中80%~90％的肝细胞结合了siRNA。并且，RNAi发挥功能达10d，3周后才完全衰退。由于Fas很少在肝细胞外的其他细胞高水平表达，它对其他器官几乎没有副作用。此外，这个小组还和其他研究者积极开展针对HIV的RNAi测试，目前报道他们使用的针对CCR5蛋白的siRNA能阻止HIV进入免疫细胞约3周，在已经感染的细胞中也能阻止感染病毒的复制。然而，尽管取得了不少研究成果，但要真正用于医疗还需时日。目前大多数还停留在小鼠测试阶段，siRNA的导入多采用静脉或腹腔注射，尾部注射，细胞移植等，如何对人进行有效的给药，既能确保药效在靶器官靶组织有效释放，还要具有高度安全性等问题都需进一步研究。人们期待着RNAi引领的新医学革命的到来。在药物筛选领域，除了线虫这种低等动物的RNAi高通量药筛模式外，LaveryKS等对RNAi在药筛领域的应用前景进行了高度评价，RNAi技术将逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大工具。他对如何在药筛的各个阶段应用RNAi做了具体描述及展望，并指出将这项技术与高通量筛选、体外生物检测和体内疾病模式相结合，将提供大量基因功能方面的有用信息，在药物开发过程的多个阶段促进靶点的有效筛选。3.3抗肿瘤治疗多种癌基因可以作为靶点设计相对应siRNA[14]。BrummelkampTR等[15]用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因K2RAS(V12)的表达。对急性髓性白血病的研究已经取得了较好的结果。ScherrM等[16]以引起慢性髓性白血病和bcr2abl阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr2abl癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA,并获得了87%的有效抑制率。WildaM等[17]用siRNA抑制白血病BCR/ABL融合基因表达也取得了成功。因此，基于RNAi技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。有报道称，一种全新生物工程药品“RNA干扰剂”(非干扰素)业已浮出水面，并有望在3年内上市。经过多年的探索，科学家终于发现，在癌细胞和病毒RNA的22对碱基中有1对碱基专门负责复制工作，只要能使这对碱基“休眠”，癌细胞或病毒就会自动停止复制。这一重要发现为一种全新药物——RNA干扰剂奠定了基础。科学家们相信，艾滋病、乙型肝炎、恶性胶质瘤(恶性脑瘤)和胰腺癌等疾病有望成为RNA干扰