RNA干扰技术

浅谈RNA干扰技术什么是RNA干扰RNA干扰(RNAinterference，RNAi),又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降.2001、2002年连续被Science评为年度十大成就!目前应用的基因干扰技术DNA水平的基因干扰技术：•基因敲除技术•寡核苷酸与双链DNA（dsRNA）杂交•采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子目前应用的基因干扰技术mRNA水平的基因干扰技术：用反义RNA技术阻遏翻译过程,破坏内源性mRNA设计寡核苷酸来破坏与mRNA结合的蛋白质,使mRNA不稳定双链RNA干扰技术（RNAi）RNAi的发现和发展历程1990年，Jorgensen在对矮牵牛(petunias)进行研究中有个奇怪的发现，将一个能产生红色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫色，结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白色。“共抑制(co-suppresion)”RNAi的发现和发展历程1995年SuGuo和KenEmphues反义RNA阻断秀丽线虫par-1基因的表达实验首次发现RNA干扰现象1998年AndrewFire和CraigMello发现单链RNA抑制作用较弱，而纯化的dsRNA可高效、特异地抑制基因的表达正式提出RNA干扰的概念Nature1998；391:806-11RNAi的发现和发展历程1999年Tuschl等报道在哺乳动物中也存在RNA干扰（RNAi）2001年Berstein等提出只有21-23个核苷酸dsRNA才有特异性的阻断效应，并发现体内分解dsRNA的DICER酶RNAi的发现和发展历程2002年Novina等用RNAi技术实现了对HIV-1病毒的阻抑2004年Morris等用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制Science2004(August27)；305：1289-1292RNAi的主要特点诱导转录后水平的基因沉默具有高度的特异性抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去RNAi的作用机制RNAi的作用机制首先在线虫、果蝇、斑马鱼等生物体内阐明的。包括起始阶段和效应阶段。RNAi的主要过程起始阶段一种称为Dicer酶特异性识别，逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染、转座子的转录产物等各种方式引入的双链RNA双链RNA被切割为长度21-23nt的小分子干扰RNA（siRNAs）RNAi的主要过程效应阶段小分子干扰RNA（siRNA）结合一个核酶复合物形成RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）RISC被激活后,通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置特异性切割mRNA,降解靶mRNA，导致基因表达失活Dicer酶RNAaseIII家族成员。包括螺旋酶结构域、RNA酶Ⅲ结构域，双链RNA结合位点以一种以ATP依赖的方式逐步切割dsRNA对单链RNA没有活性对200~500碱基的dsRNA作用效果最好，能降解成22nt左右的小分子干扰RNA(siRNA)广泛存在RNaseIIIdomainconnectorhelixamino-terminalhelicasedomaindsRNA结合区域RNA解旋酶活性区III型RNA酶活性区域Dicer酶结构示意RNAi的放大效应机制一些生物体内存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRp），这种扩增可复制外源注入的双链RNA，或者是直接扩增经切割后的小分子干扰RNA（siRNAs）在RdRp的作用下，进入细胞的双链RNA类似与PCR反应过程，呈指数级数量扩增RNAi技术的实验方法siRNA的设计原则：序列大小19-21nt，最好以A或G开始从mRNA的AUG开始，寻找AA二连序列，作为潜在的RNAi靶位点至少选择4个以上的靶位点经GenBank数据库BLAST分析各潜在位点，去除那些与其他基因明显同源的靶位点设计适当的阴性对照序列选择GC含量较低的siRNA，一般是40%—55%选择高纯度的siRNA，推荐使用玻璃纤维结合纯化或通过15%—20%丙烯酰胺去除那些在外合成时所产生的多余核苷酸、小寡核苷酸、蛋白和盐离子。对于化学合成的siRNA需用PAGE胶进行纯化，以确定siRNA的纯度。避免RNA酶污染，可使用市售的除RNA酶喷剂、实质及相关液剂，采用无血清培养基必要时，采用荧光标记的siRNA来分析siRNA的稳定性和转染效率。目标序列筛选的相关网站://sfold.wadsworth.org/sirna.pl://RNAiDesigner.invitrogen.com://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/rnai.html查找已经证实的siRNA的网站=49://web.mit.edu/mmcmanus/://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=PublishedsiRNA的制备方法化学合成siRNA体外转录获取siRNA利用Dicer消化长的dsRNA成siRNAsiRNA载体目前常用的载体系统有质粒表达载体和病毒表达载体。常用的启动子依赖RNA聚合酶III(polIII)，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。如人源U6启动子，鼠的U6启动子，人H1启动子等polIII可在细胞中表达许多的小分子RNA，通过添加一串（3~6个）U来终止转录的表达载体法制备siRNA优点：可以进行较长期研究。载体可以在细胞中持续抑制靶基因达数星期或更久缺点：需要进行克隆，周期长，质粒载体表达效率较低siRNA转染细胞磷酸钙共沉淀电穿孔法机械法：显微注射和基因枪阳离子脂质体试剂提高转染效率的方法纯化的siRNA避免使用抗生素避免RNA酶污染较低传代数的细胞合适的转染试剂合适的阳性对照荧光标记的siRNARNAi技术的应用高通量的研究基因功能基因敲除基因治疗基因表达调控研究信号传导通路的新途径•在后基因组时代，需要大规模高通量的研究基因的功能，由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默获得功能丧失或降低突变，能高效特异性地阻断基因的表达，因而RNAi称为研究基因功能很好的工具。•现通过转染siRNA在哺乳动物细胞中诱发RNAi，已开始应用于研究人类。•与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。RNAi作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基因。肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA即可以使多个基因同时沉默。JudeLieberman等已经成功地利用RNAi技术治愈了实验鼠的肝炎。他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质（FAs）基因”。FAs存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了FAs基因所导致的。JudeLieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默”FAs基因的siRNA，发现有90％的肝细胞接收到了这种RNA分子，FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未接受RNAi治疗的实验鼠有40％在３天内死亡。而40只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来，10天后研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。基因表达调控siRNA可指导细胞的定向分化。现已证实能引导植物干细胞的分化。由于在基因表达调控中发挥重要的作用，对RNAi微小的干扰就可能导致肿瘤的发生。THANKYOU！