SDS-PAGE检测分析

一、实验目的和要求1．学习SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)的基本原理和操作方法。2．蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析。3．学习测定蛋白质相对分子质量(Mr)的方法。二、实验内容和原理1.电泳是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即向着与其电荷相反的电极移动的现象。2．电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所产生的电泳迁移率的差别。3.区带电泳：是样品物质在一惰性支持物上进行电泳,因电泳后，样品不同组分形成带状区间，故称区带电泳。4．聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,简称PAG)是由丙烯酰胺（Acr)和交联试剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在有引发剂（如过硫酸铵或核黄素）和增速剂（如N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，TEMED）的情况下聚合而成的。5.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，这主要是由蛋白质样品所带的电荷和分子质量的差异性进行分离；在电泳过程中仍保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性。6、聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为：⑴连续系统：凝胶缓冲液的pH值及凝胶浓度不变。该电泳系统具有电荷效应、分子筛效应；⑵不连续系统：凝胶缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度、电位梯度不连续，由浓缩胶和分离胶组成。由于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品（即使是稀释样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。该电泳系统具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。7.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以PAG为支持物的电泳，由于各种蛋白质所带静电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。为消除静电荷对迁移率的影响，在整个电泳体系中加入一定量的阴离子去污剂“十二烷基硫酸钠（简称SDS）”和“强还原剂（巯基乙醇）”后，蛋白质样品就会与SDS结合形成带负电荷复合物，而SDS作为一种变性剂和助溶剂，它能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键，并结合到蛋白质分子上，使分子去折叠，破坏蛋白质分子内的二级和三级结构，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。另外，SDS－蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，可打开蛋白质分子内或肽链间的二硫键，并能避免重新氧化，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。蛋白质亚基的电泳的迁移率主要取决于亚基的相对分子质量大小，而电荷的因素可以忽略。8．蛋白质亚基相对分子质量的测方法在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质－SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只主要取决于它的椭圆棒的长度即蛋白质的相对分子质量的大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。由于蛋白质的相对分子质量不同，所形成复合物的相对分子质量不同，在电泳中反映出不同的迁移率。当蛋白质或亚基的相对分子质量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈直线关系，符合下列方程式：lgMr=K－bRf式中Mr代表相对分子质量，K代表常数，b代表斜率，Rf代表迁移率。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得蛋白质相对分子质量。三、实验材料和试剂1．实验材料：蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）2．实验试剂：(1)30.8%凝胶贮液：丙烯酰胺(Acr)30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加水溶解，并加水定容到100ml，过滤。贮于棕色瓶，可在4℃保存一个月。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物，要小心操作。(2)分离胶缓冲液：3mol/LTris-HClpH8.9(3)浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HClpH6.7(4)10%SDS(5)TEMED(N,N,N′,N′－四甲基乙二胺）(增速剂）(6)10%过硫酸铵（引发剂）(7)电泳缓冲液（pH8.3）：Tris6g，甘氨酸28.8g，SDS2g，用蒸馏水溶解并定至1000ml,使用时稀释1倍。(8)蛋白质样品溶解液（2×蛋白质样品溶解液）：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LTris-HClpH8.0缓冲液。(9)染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250或G-250，加90.8ml50%甲醇，加9.2ml乙酸，溶解混匀后使用。(10)脱色液：75ml乙酸，50ml甲醇，加蒸馏水875ml，混匀使用。(11)蛋白质分子量标准溶液：①β-半乳糖苷酶（MW116,000）②牛血清白蛋白(MW66,200)③卵清蛋白（MW45,000）④乳酸脱氢酶（MW35,000）⑤限制性内切酶Bsp981（MW25，000）⑥β-乳球蛋白（MW18,400）⑦鸡蛋清溶菌酶（MW14,400）四、实验器材与仪器1．电泳仪、垂直电泳槽及配件（长短玻璃板各1块、封胶条2条、梳子1个）2．微量移液器：1000μl、200μl、10μl3．烧杯、长滴管4．微量注射器50μl5．恒温水浴100℃6．高速台式离心机7．离心管（1.5ml、0.5ml）及离心管架8．￠15cm培养皿（染色、脱色用）9．摇床（染色、脱色用）五、操作方法和实验步骤1．准备电泳装置：电泳槽、电泳仪。2．配胶及凝胶的制备（1）配制凝胶：注：1、为去除抑制胶聚合的氧，加入AP前可进行抽气处理；2、过硫酸铵和TEMED的量应根据室温或聚合情况而定；3、混匀后立即灌注凝胶和用手封顶。⑵凝胶板的制备①分离胶的制备：按上表配制7.5ml分离胶，混合均匀后将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，再用少许蒸馏水（或水饱和的异丙醇或正丁醇）沿长玻璃板板壁缓慢注入，约5mm高，以封住胶面，以促使聚合并使胶面平直，约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合，倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余的水分。②浓缩胶的制备：按上表配制2.5ml浓缩胶，混匀后将浓缩液加到已聚合的分离胶上方，直至离短玻璃板上得约0.1cm处，轻轻将样品槽模板（梳子）插入浓缩胶内，约10min后凝胶聚合。小心拔去样品槽的槽板（梳子），将电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，电泳缓冲液应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。3.样品处理与加样（1）样品制备取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50ul，分别放入1.5ml离心管中，12000r/min离心15min,收集上清为样品溶液。（2）样品处理将样品溶液分别按等体积加入“2×SDS蛋白质上样缓冲液”，100℃保温3分钟。（3）加样用微量注射器向样品槽内注入3～10μl样品混合液。如样品浓度较低，可适当增加上样量。4.电泳在电泳槽中加入电泳缓冲液，上槽（加样孔端）接负极、下槽接正极，接电泳仪电源，电流控制在2～3mA/样品孔，一般样品进浓缩胶前，电流控制在10～20mA，待样品进分离胶后，将电流调到20～30mA，保持电流强度不变（恒流），待指示染料迁移至下沿约0.5～1cm处停止电泳。5.剥胶电泳结束后，取下凝胶模，用专用铲子撬开短玻璃板，将凝胶一角切下做一加样标记，将凝胶板放在￠15cm培养皿内，用去离子水漂洗2次，每次3分钟。6.染色加入染色液，染色30min左右.7.脱色弃去染色液，加入蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰为止。