基础生物化学实验法

1基礎生物化學實驗法(1)IntroductiontotheBiochemistryLaboratory(2)GeneralLaboratoryProcedures(3)化學實驗操作法(4)免疫化學分析之各種方法(5)原子吸光法之基本原理及測定2IntroductiontotheBiochemistryLaboratory3GeneralLaboratoryProcedures456化學實驗操作法(2008.7.9)I基本操作1.粉碎2.混合3.溶解4.加熱5.冷却(1)液體之冷却(2)固體之冷却(3)冷却劑6.攪拌7.減壓8.蒸發9.乾燥(1)器具之乾燥(2)乾燥劑(3)液體之乾燥(4)固體之乾燥10.蒸留II分離操作1.抽出(1)水及有機溶劑之相互溶解度(2)以分液漏斗抽出(3)以自働抽出器抽出2.鹽析3.過濾(1)普通過濾(2)減壓過濾7ExtractionandisolationofpurecompoundsExtraction:Itiscustomarytoseparatethecomponentsofapreviouslyunknowncompoundsbyextractionwithsolventsonincreasingpolarity.Withdriedmaterialthiscanbeproceedbysublimationandsteamdistillationonasample,followedbyextractionwiththeseries:lightpetroleum,ether,chloroform,ethanol(or80%aqueousethanol),andwater(successivelycold,warm,acidandalkaline).Thefurtherfractionationoftheextractobtainedisamatterwhichhastobeplannedaccordingtotherequirementsofagivingsituationbearinginmindthepropertiesofthecompoundstobeextracted.Exceptwhereisolationofessentiallyonecompoundbycrystallization,distillation,orsublimationispossible,thegreatvarietyofchromatographic,electrophoresis,andmultipledistributiontechniquesplayvitalpartinsubsequentoperations.8heptaneVI水(多価alcohol,…)(hydrocarbons,CS2,CCl4…)IVIICHCl3alcoholCHCl2(methanol,phenol…)CH3CHCl2,CH2Cl、CH2Cl…IIIether,ketonealdehyde…溶媒之分類完全混合不完全混合(少量互溶)不能混合9免疫組織化學方法研究胞外母質及其受體(Immunohistochemicaltechniquestostudytheextracellularmatrixanditsreceptors)基本方法書1.Antibodies(Harlow&Lane,1988)2.Usingantibodies,1998)3.專書Immunochemistryoftheextracellularmatrix,Vol.I,Vol.II4.MethodsinEnz.1.Review(MethodsinEnz.Vol.245,pp.316-346)2.參考文獻○1染色laminin,nidogen,及collagentypeIV○2collagens○3fibroblast之markerthy-1○4精子材料及方法1.Zn-bindingprotein抗體2.市售抗體CollagenICollagenIIICollagenIVLaminin3.市售Immunohisto-chemicalkit4.poly-lys5.96孔盤6.螢光顯微鏡10免疫化學分析之各種方法1.染色方法(1)Immunohistochemical(IHC)methoda.horseradishperoxidase-labeledreagentsb.alkalinephosphate-labeledreagents(2)Immunofluororescence(IF)method2.immunoassay(ELISA)3.染色材料(1)stainingcells(2)stainingtissues(3)Immunoblotting11原子吸光法之基本原理及測定鄭森雄1974年1月14日初稿2001年6月13日修正12第一章原子吸光法之基本原理1.原理2.原子吸光與原子濃度之關係3.原子化步驟第二章火焰原子化第三章測定(一)機器使用時注意事項1.光源2.測定波長之調整3.燃燒器4.化霧器5.燃料之混合比及氣體系統(1)燃料混合比(2)氣體系統6.試料送入量7.其它注意事項(二)容器及其清洗1.容器之種類(1)玻璃容器(2)聚乙稀(3)聚四氯乙稀2.容器之清洗13(三)試葯之調製1.試葯(1)無機酸類(2)蒸餾水2.標準液(1)保存用標準液(2)使用之標準液(3)標準曲線之製作(四)試料之調製(1)乾式灰化法(2)濕式分解法(a)硝酸-硫酸分解法(b)硝酸-過氯酸(HNO3-HClO4)分解法(c)硝酸-硫酸-過氯酸分解法(水銀之定量法)第四章溶劑之抽出1.有機溶劑燃燒時應注意事項2.抽出用之有機溶劑(1)溶劑之選擇(2)溶劑間的互溶性3.抽出之操作4.有機螯合劑14第一章原子吸光法之基本原理1.原理所有的原子皆會吸收光，但只有在相當於其能量需求之波長方會吸光。例如鈉原子，於589.0nm有非常強烈的吸光現象，因為光在此波長之能量，恰好能使鈉原子轉移(transform)至其他電子狀態(eletronicstate)。鈉原子之這種電子轉移現象，非常具有特異性，其他元素之原子因與鈉原子不同，其能量需求(energyrequrement)也就不同，因此在589.0nm波長即不會吸光。當鈉原子吸收光以後，它即由基底狀態(groundstate)轉移至激起狀態(excitedstate)，此時鈉原子仍然是鈉原子，但它含有較多之能量。鈉原子有數種激起狀態，而每一種狀態皆存具特殊之能量。通常，此等能量之大小係以其與基底狀態之差而定。因此，我們可說，對鈉而言，某一特殊激起狀態是高於基底狀態2.2ev。此即表示某一原子在激起狀態較基底狀態多了2.2ev之能量。通常我們以0.0ev表示基底狀態。鈉原子之某些能量狀態(energystate)如表一所示。在不同電子能階中，每一種轉移(transition)，都需要不同之能量，因此有不同之波長。在某一系列之波長中，每一條特定的波長有一個明顯之最大強度(sharpintensitymaximum)或稱為光譜線(spectroscopicline)。原子光譜即由此等特定的線組成。此種光譜與分子所形成之寬帶光譜(broaderbondspectra)不同。原子吸光法(atomicabsorptionspectroscopy)測定上最有用者係由基底態所產生之線，此種線稱之為共鳴線(resonancelines)。每一種元素之原子光譜中包含有數條分離線。其中某些線是共鳴線，某些線不由基底態升起，而是由激起狀態升起。在實際原子吸光儀上，樣品之原子多數皆在基底狀態上，因此在原子吸光分析上，我們所利用的，係共鳴線。152.原子吸光與原子濃度之關係原子吸光與濃度之關係可由Lambert's-Beer's定律來表示：Pt=Poe(-abc)log10Po/Pt=abc=吸光度(absorbance)Po=入射光Pt=射出光a=吸收常數b=吸收通路之長度c=吸收原子之濃度因此，假設某一樣品之濃度為C，其吸光度(absorbance)為X；則濃度增加至2C，其吸光度將為2X。吸光度即為測量在某種條件下，光被原子所吸收之量。Lambert-Beer定律使測定者能夠由吸光度之大小，測量樣品中原子之濃度。原子吸光儀，即為測定此吸光度之裝置，而使測定者能由吸光度求得樣品中原子之濃度。理論上，我們可由方程式(1)，求得濃度。但在實際上，方程式(1)中之a與b，皆為常數，通常並不需要測定。原子化法是最廣為人用的方法，所以詳細了解火焰原子化法之機械及化學原理，可說是原子吸光分析之基礎。3.原子化步驟原子吸光儀的燃繞系統，係以下列步驟將試料溶液原子化：(1)噴霧(nebulization)(2)顆粒沈下(dropletprecipitation)(3)混合(mixing)(4)乾燥(desolvation)16(5)分解化合物(compounddecomposition)首先，試料溶液必須先經氣體噴霧器(pneumaticnebulizer)轉變成細小的顆粒。氣體噴霧器之形狀及幾何構成如圖4所示。在實際的操作中，氣體(火焰之氧化劑)首先通過噴霧器，在通過venturi時產生了減壓。因此，試料溶液就以1-4ml/min之速度被吸入venturi。在碰到流動極快的氣流時，這些試料溶液就被粉碎成直徑1-100μm之微細顆粒。此等水霧被氣流帶入噴霧室(spraychamber)時，碰到一個障礙物～通常是可以調節位置的玻璃珠(glassbead)。當高速度的水霧碰到此玻璃珠時，水霧的速度大變，許多較大的顆粒就變成微細顆粒。然後，微細顆粒即與氧化劑進入噴霧室。在噴霧室，氧化劑與水霧即與燃料氣體混合。在此處，噴霧室容積、及流向之改變，產生了渦流，因此試料水霧、氧化劑、燃料氣體三者即混合均勻。因為噴霧室形狀，因此，原子吸光法之使用,平常係測定已知濃度標準溶液之吸光度，再將未知樣品之吸光度與此結果比較。其法為，將標準溶液所測得之點連接起來，在Beer-Lambert定律下，此曲線為直線，通常稱之為標準曲線(standardcurve)或校準曲線(calibrationgraph)，未知樣品之原子濃度即可由插入法(interpolation)求得。如圖2所示，此種以標準曲線求得未知樣品之方法，極為方便、準確。上述標準曲線，通常皆為直線，但在實際上，有許多光譜學上及機器設計上之因素，會使此直線稍為彎曲，尤以在高濃度為甚。此將於下文中詳細述及。17第二章火焰原子化(flameatomization)原子吸光分析方法最主要的測定依據是非結合的原子(uncombinedatom)會吸收某一特殊波長之光。所以如何使樣品中之元素轉變為自由，不與其他元素結合之基底狀態，即將某一元素原子化(atomization)，自是原子吸光儀操作能否成功之主要因素。因此，每一個分析者，都必須完全了解此種原子化(即產生原子群atompopulation)的過程，以求得最佳之分析結果。基本上，原子化之過程，是將分析溶液，加熱至某一能使化合物分解之溫度，以達到原子化之目的。通常，係以火焰加熱方式供給熱能，雖然在近年來無焰原子化(non-flameatomization)的技術也已經有許多人在使用。因為火焰原的關係，混合物渦流即轉變成直線流型(laminarflowpattern)。此種直線流型使得火焰較為穩定及平靜。噴霧室另外有一個功用，即分離粗大的顆粒，使其沿噴霧室壁流出。有微細顆粒進入火焰，此等水霧之直徑幾乎皆小於5μm，通常在2μm以下。完全混合的氧化劑、燃料氣體及試料溶液，經噴霧室後即進入噴燃口(burner)，進入火焰燃燒。火焰之熱量，足夠乾燥(desolate)試樣顆粒之水粒，並能使試樣中之化學化合物分解成具結合的原子。因此在火焰中，即產生一群基底狀態之原子，而原子吸光測定即能進行。18第三章測定技術上應注意之問題(一)機器使用時應注意事項：1.光源：中空陰極燈管不可通過太大的電