SNP检测方法

一大类是以单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DDGE)、酶切扩增多态性序列(CAPS)、等位基因特异性PCR(allele-specificPCR,AS-PCR)等为代表的以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法另一大类是以直接测序DNA芯片变性、高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术高分辨率溶解曲线(HRM)等为代表的高通量自动化程度较高的检测方法。1.单链构象多态性(SSCP)方法的原理是PCR扩增的DNA片段在变性剂条件下，通过高温处理使双链DNA扩增片段解旋并且维持单链状态，进一步进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于DNA单链的空间构象决定着其迁移率，相同长度的DNA单链，若某单个碱基存在差异，则形成迥然不同的空间构象，就会显示出带型的差异(多态型)。优点：该方法简便灵敏快速成本低缺点：PCR-SSCP适用于小的DNA片段，长度小于500bp，如果DNA片段太长，DNA单链很难形成稳定发夹结构。但是该方法只能对突变进行较为粗略地检测，不能确定突变的具体位置和类型；而且对电泳条件的要求非常严格。2.变性梯度凝胶电泳(DDGE)在DNA序列中，4种碱基的组成和排列存在差异，致使不同序列的DNA双链有着不同的解旋温度当DNA分子在含浓度梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，由于解旋的状况与其序列高度相关，使得不同DNA片段形成相互分开的条带。DGGE利用双链DNA分子在含有一定浓度梯度变性剂的凝胶中进行电泳时，由于存在突变的双链DNA分子和不存在突变的双链DNA分子在不同的部位解旋而区分即使只有一个碱基对的不同，两个双链DNA分子在不同的时间发生部分解旋，随之形成有差异的电泳条带。由于存在突变DNA片段和正常DNA片段的Tm值有差异，从而发生迥然不同的解旋行为，TGGE通过设置温度梯度在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离DNA差异片段。优点：DGGE能够检测长达1kb的DNA片段，若SNP恰好出现在发生部分解旋的DNA区域内，其检出率可以高达100%，特别是100~500bp长度的片段。缺点：该方法也只能对突变进行较为粗略地检测，一般不能确定突变位置和类型。3.酶切扩增多态性序列(CAPS)CAPS又称为PCR-RFLPCAPS是将PCR技术与RFLP技术相结合，利用DNA片段在酶切位点上碱基的变异，采用相应的限制性内切酶，对该DNA片段的PCR扩增产物进行酶切，因而产生多态性。CAPS首先是对目标SNP所在的DNA片段设计特异性引物并对其进行扩增，然后用限制性内切酶对该DNA片段的PCR扩增产物进行酶切，再通过凝胶电泳进行检测，形成分子标记。对于那些不能转化成为CAPS的SNP，可以将其转化为衍生酶切扩增多态性。优点：如共显性、位点特异性高、操作较简单和成本较低等。缺点：仅仅能够检测出位于酶切位点处的SNP，对位于酶切位点以外的SNP的检测则无法实现。4.等位基因特异性PCR(allele-specificPCR,AS-PCR)AS-PCR的原理是由于TaqDNA聚合酶对位于引物3'末端的单个碱基的错配无法修复，当引物3'末端的碱基与SNP位点的等位基因互补配对时，才能发生扩增反应；当引物3'末端的碱基与SNP位点的等位基因不互补配对时，则扩增反应不能发生。每个SNP的检测都需要根据其具体位点设计三条不同的引物，其中一条是通用的引物，另两条是分别对应SNP位点的两个等位基因的特异性引物。对PCR产物进行电泳检测后，通过电泳条带的有和无就可以确定SNP的基因型。理论上，引物3'末端的碱基与DNA模板发生完全互补配对时，DNA聚合酶才能使扩增有效地进行；但实际上，在一些情况下即使引物3'末端的碱基与DNA模板不能够发生完全的互补配对，但是延伸仍然可以发生。为解决这一问题，人为地在3'末端倒数第二或第三位引入错配碱基能够显著提高引物的特异性。目前，已出现了基于AS-PCR改良的一些方法，如四引物扩增受阻突变体系PCR、片段长度差异等位基因特异PCR、多等位基因特异扩增。优点：AS-PCR具有简便快速能对SNP进行分型以及费用低等优点。缺点：该方法由于特异性引物的稳定性差，对扩增条件要求比较严格，所以操作比较繁琐，因此不适于高通量SNP的检测，只适于较小规模SNP的检测。