SOP-QC-396-00甲醇酵母工程菌菌体蛋白残留量测定标准操作规程

上海腾瑞制药有限公司此文件内容属上海腾瑞制药有限公司所有，未经批准，不得复印。标准技术文件文件名：甲醇酵母工程菌菌体蛋白残留量测定标准操作规程Page1of3文件编号：SOP-QC-396-00起草部门QC起草/修订人部门审核QA审核起草/修订日期审核日期审核日期质量负责人生产负责人N/A企业负责人N/A批准日期批准日期N/A批准日期N/A复审日期执行日期有关部门会签/日期/需分发数质量保证部QA质量控制部QC一、目的为了规范原液等样品中甲醇酵母工程菌菌体蛋白残留量检测的方法和操作，特制订本规程。二、范围本规程适用于原液等样品中甲醇酵母工程菌菌体蛋白残留量的检测。三、责任QC检验人员对实施本规程负责。四、内容1检验依据：《中国药典》2010年版三部酵母工程菌菌体蛋白残留量测定法(附录ⅨE)。2检验原理：本法系采用酶联免疫法测定甲醇酵母表达系统生产的原液等样品中工程菌菌体蛋白的残留含量。3仪器与用具：酶标仪、加样器、恒温培养箱、旋涡震荡器、摇床。4试剂试液4.1实验材料：甲醇酵母工程菌菌体蛋白残留量测定试剂盒（CYGNUSF140）4.1.1试剂盒组成：酶标板、甲醇酵母菌菌体蛋白标准品（规格为0ng/ml、1ng/ml、4ng/ml、20ng/ml、75ng/ml、250ng/ml）、亲和素标记抗甲醇酵母蛋白抗体（Anti-P.pastoris：HRP）、TMB显色底物、终止液、20×洗涤浓缩液。4.210mMPBS（pH7.0）缓冲液：氯化钠(NaCl)8g、氯化钾(KCl)0.2g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.44g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g、加800ml纯化水，用1M的HCI或NaOH上海腾瑞制药有限公司标准操作规程文件名：甲醇酵母工程菌菌体蛋白残留量测定标准操作规程Page2of3文件编号：SOP-QC-396-00执行日期此文件内容属上海腾瑞制药有限公司所有，未经批准，不得复印。调pH至7.0后，用纯化水定容至1L，室温保存。5.操作步骤5.1样品处理：将原液蛋白用10mMPBS（pH7.0）缓冲液稀释至0.1~0.3mg/ml，备用。5.2加样：5.2.1酶标板中，分别加入25μl/孔标准溶液（0ng/ml、4ng/ml、20ng/ml、75ng/ml、250ng/ml）、2复孔。5.2.2加入25μl/孔待检样品（稀释后的原液蛋白），2复孔。5.2.3加入25μl/孔10mMPBS（pH7.0）作为空白对照，2复孔。5.2.4设定摇床操作参数：室温（24℃±4℃），不超过180rpm；将加样后的96孔板放入摇床震荡培养1小时。5.3洗涤：5.3.1轻轻倒出每孔中的液体，并用吸水纸吸尽每孔中的液体。5.3.2每孔用350μl、1×洗涤液漂洗后吸去洗涤液，并用滤纸吸走剩余的液体，共洗板4次；最后1次，要尽可能的去除所有的洗涤液体。5.4加抗体：5.4.1每孔加入100μl亲和素标记抗甲醇酵母蛋白抗体（Anti-P.pastoris：HRP）。5.4.2设定摇床操作参数：室温（24℃±4℃），不超过180rpm；将加样后的96孔板放入摇床震荡培养1小时。5.5洗涤：5.5.1轻轻倒出每孔中的液体，并用吸水纸吸尽每孔中的液体。5.5.2每孔用350μl、1×洗涤液漂洗后吸去洗涤液，并用滤纸吸走剩余的液体，共洗板4次；最后1次，要尽可能的去除所有的洗涤液体。5.6显色：5.6.1每孔加入100μlTMB显色底物，室温下孵育30分钟。5.6.2每孔加入100μl终止液。5.7酶标仪读板与计算5.7.1用酶标仪读取450nm/650nm波长OD值，具体操作见《MultiskanMK3型酶标仪标上海腾瑞制药有限公司标准操作规程文件名：甲醇酵母工程菌菌体蛋白残留量测定标准操作规程Page3of3文件编号：SOP-QC-396-00执行日期此文件内容属上海腾瑞制药有限公司所有，未经批准，不得复印。准操作规程》（SOP-QC-258最新版）。5.7.2应用计算机软件进行读数和数据分析。以标准品A值对浓度作曲线，并以待检样品A值在曲线上读出相应的菌体蛋白含量，按以下公式计算待检样品中菌体蛋白残留含量。待检样品中菌体蛋白残留含量%=(C×D)/(T×106)×100%其中C：实测待检样品菌体蛋白质含量(ng/ml)D：待检样品稀释倍数T：待检样品总蛋白质含量(mg/ml)五、变更记录版本号变更内容执行日期00新建六、附件附件一《甲醇酵母工程菌菌体蛋白残留量测定检测记录》R-SOP-QC-396-00上海腾瑞制药有限公司R-SOP-QC-396-00此文件内容属上海腾瑞制药有限公司所有，未经批准，不得复印。附件一第1页甲醇酵母工程菌菌体蛋白残留量测定检测记录仪器：酶标仪型号：编号：摇床型号：编号：试剂试液：试剂名称生产厂家批号或货号甲醇酵母工程菌菌体蛋白残留量测定试剂盒0.01MPBS（pH7.0）供试品稀释：蛋白含量(mg/ml)稀释倍数原液取用量(l)稀释液用量(l)终浓度(g/ml)检验：步骤描述加样1加入25μl/孔标准溶液（0ng/ml、4ng/ml、20ng/ml、75ng/ml、250ng/ml），2复孔。2加入25μl/孔待检样品（稀释后的原液蛋白），2复孔。3加入25μl/孔10mMPBS（pH7.0）作为空白对照，2复孔。4设定摇床操作参数：室温______℃（24℃±4℃），转速_______（不超过180rpm）；将加样后的96孔板放入摇床振荡培养1小时，振荡培养起止时间______：______~______：______。洗涤1.轻轻倒出每孔中的液体，并用吸水纸吸尽每孔中的液体。2.每孔用_____μl(350μl)、1×洗涤液漂洗后吸去洗涤液，并用滤纸吸走剩余的液体，共洗板_____次（4次）；最后1次，要尽可能的去除所有的洗涤液体。上海腾瑞制药有限公司R-SOP-QC-396-00此文件内容属上海腾瑞制药有限公司所有，未经批准，不得复印。加抗体1.每孔加入_____μl（100μl）亲和素标记抗甲醇酵母蛋白抗体（Anti-P.pastoris：HRP）。2.设定摇床操作参数：_____℃（24℃±4℃），______rpm(不超过180rpm)。3.将加样后的96孔板放入摇床震荡培养1小时，振荡培养起止时间______：______~______：______。洗涤1.轻轻倒出每孔中的液体，并用吸水纸吸尽每孔中的液体。2.每孔用_____μl(350μl)、1×洗涤液漂洗后吸去洗涤液，并用滤纸吸走剩余的液体，共洗板_____次（4次）；最后1次，要尽可能的去除所有的洗涤液体。显色1.每孔加入_____μl(100μl)TMB显色底物，室温下孵育30分钟，起止时间______：______~______：______。2.每孔加入100μl终止液。读数用酶标仪读取450/650nm波长OD值。结果：（1）标准品浓度（ng/ml）042075250OD平均值回归方程（2）供试品OD平均值菌体蛋白浓度(ng/ml)供试品蛋白含量(mg/ml)稀释倍数残留菌体蛋白含量(%)结论：□符合规定□不符合规定（内控标准：宿主菌体蛋白残留不超过总蛋白量0.050%）检验人：____________________；复核人：_____________________检验日期：__________________；复核日期：___________________