Southern_blot实验方法与步骤

实验名称：Southernblot一、实验目的1．学习核酸杂交的基本过程和操作。二、实验原理将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。三、试剂与仪器（一）器材：糖瓷盘，台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪，摇床，X线胶片。（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNALadderMarker，0.25MHCl变性液（0.5MNaOH，1.5MNaCl）中和液（0.5MTris-HClPH7.5，3MNaCl）,转印迹液SSC（3MNaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0）标记探针，20×SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）2×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS)1×缓冲洗液（0.1M马来酸0.15MNaCl,PH7.5,0.3%Tween20）1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于]1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15MNaCl,PH7.51×检测液（0.1MTris-HCl,0.1MNaCl,PH7.5）抗－地高辛－碱性磷酸酶。四、实验步骤1、制备DNA分子（PCR）2.琼脂糖凝胶电泳分离DNA3电泳结束后，将胶小心从电泳槽中取出，用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪，然后将胶放入0.25NHCl中脱嘌呤，当胶中的溴酚蓝变为黄色取出4将胶从HCl溶液中取出，用ddH2O涮洗两次，然后放入碱变性液（0.5MNaOH）中处理45min，使胶中的ds-DNA变为SS-DNA。5取一个瓷盘，注10×SSC，横跨窄边架上一块玻璃板，在玻璃板上铺2层30cm×10cm滤纸，纸条长两侧垂入10×SSC中6将胶底朝上放在滤纸上7裁与胶同样大小的尼龙膜平铺到胶上8用塑料布盖住尼龙膜四周，裁与尼龙膜同样大小的滤纸一张，铺在尼龙膜上。9叠5至8cm高的吸水纸，再压一重物，放置过夜10转印结束后，将尼龙膜切角做记号，放到一张滤纸上，紫外交联30s11预杂交：将尼龙膜放入到杂交管中，倒入预杂交液，在杂交炉上42℃，低速转动1h。12杂交：弃预杂交液，往管中导入杂交管液，42℃，6-20h。13回收杂交液冻存，往管中加入50ml2×SSC/01%SDS洗5min重复一次。14往杂交管中加入66℃预热的50mL0.5×SSC/0.1%SDS，66℃洗涤30min，重复一次。15齐洗液，加入washingbuffer（马来酸buffer/0.3%Tween20）浸泡5min。16加入100mLblockingbuffer（封闭液），室温，1h17倒掉杂交管中的blockingbuffer，加入抗体溶液，25℃，温育1h。18加入500mlwashingbuffer，洗2h19将尼龙膜从杂交管中取出，放入盛有detectionbuffer（pH9.5）的大培养皿中，浸泡5min。20将尼龙膜铺到一张大保鲜膜上，均匀滴加800μLCSPD溶液，将另一侧的尼龙膜平整地覆盖到膜上，轻轻挤走气泡。37℃，温育10min。21将尼龙膜铺到暗匣中，在暗室中压上X光胶片，压片2h。22洗片：暗室中，将胶片依次放入显影液3min，定影液1min。然后用自来水将胶片充分涮洗后晾干。五实验结果与分析