大蒜新素及其衍生物对兔痒螨的体外杀螨活性研究

大蒜新素及其衍生物对兔痒螨的体外杀螨活性研究任方奎何小燕李逐波（西南大学药学院，重庆北碚400716）来源：原作收稿：2009-11-21南宁兽药科技网上传时间：2009-12-1编辑:dongy大蒜新素是从大蒜（Alliumsativum）中提取的一种具有很强刺激性的挥发性油状物质，其化学名称为二烯丙基三硫醚，该化合物可以人工合成[1]。大蒜新素具有很强的抗菌[2]、抗病毒[3]、抗肿瘤[4]、抗癌[5]等多种药理活性。但大蒜新素在抗寄生虫方面的报道很少，LunZR等[6]曾报道大蒜新素可以治疗贾第虫病和有溶组织内阿米巴（Entamoebahistolytica）和滴虫性阴道炎（Trichomonasvaginalis）等疾病。目前为止，大蒜新素及其衍生物对兔痒螨的研究还未见报道。本文主要研究大蒜新素及其衍生物对兔痒螨的体外杀螨活性，测定半数致死时间（LT50）和半数致死浓度（LC50），并对大蒜新素及其衍生物的构效关系进行了初步探讨。1试验材料1.1供试动物自然感染螨病的家兔6只，雌雄兼有，平均体重2.0±0.5kg。由重庆市北碚区某兔场提供。1.2仪器与试剂倒置显微镜，20孔细胞培养板，挑虫针，大蒜新素（南通鑫利化工有限公司，批号：XY070705），二丁烯三硫醚、二戊烯三硫醚和二己烯三硫醚均有本实验室合成[7]，伊维菌素（河北威远动物药业有限公司），硫软膏（成都明日制药有限公司）。2方法2.1药品配制精密称取1.0g大蒜新素及其衍生物于10mL的容量瓶内，加0.1mL吐温-80用水定容至刻度，混匀，即得100mg/mL的储备药液，4oC冰箱中保存备用。精密称取0.25g的阿维菌素于10mL的容量瓶内，加0.1mL的吐温-80，用水定容至刻度，混匀，即得浓度为25mg/mL的阿维菌素，作为阳性对照液。取0.1mL的吐温-80于10mL的容量瓶内用水定容，作为阴性对照液。2.2离体杀螨试验[8][9]*通讯作者：西南大学药学院，E-mail:[e-mail]2.2.1痒螨的采集用小镊子剥取自然感染螨虫病家兔的耳道痂皮及脓血置平皿内，平皿边缘涂少量的硫软膏。置30oC温箱内保存30min使虫爬出，借助放大镜，用挑虫针挑取螨虫，在显微镜下对兔痒螨的形态学进行观察[10]，鉴定为兔痒螨。2.2.2杀螨活性的测定将试验分为药物组、阳性对照组和阴性对照组。药物组：在20孔细胞培养板的每孔各加入100mg/mL供试药物0.2mL。阳性对照组：20孔细胞培养板每孔各加入10mg/mL的阿维菌素0.2mL。阴性对照组：在培养板的每个孔中加0.2mL的阴性对照液。每组设置3个重复。每孔放置痒螨10只，在10×40倍显微镜下观察，分别记录螨的死亡时间。判定标准：虫体淋巴液流动，虫体不动但刺激有反应或长时间微弱颤动为麻醉；虫体淋巴液静止，虫体完全不动，刺激无反应，判定为死亡。2.2.3半数致死时间（LT50）的测定将大蒜新素及其衍生物的储备液用水稀释成浓度为20mg/mL，挑取10只螨虫置于20孔的细胞培养板中，每个孔加0.2mL药物，设置3个重复，同时以阴性对照液为阴性对照。给药后用显微镜观察，直至所有痒螨死亡，记录每个时段的死亡情况。2.2.4半数致死浓度（LC50）的测定将大蒜新素及其衍生物储备液先水稀释成4mg/mL,再倍比稀释成2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL和0.125mg/mL5个不同浓度，每个浓度设置3个重复，同时以阴性对照液为阴性对照。在培养板的试验孔中各加0.2mL不同浓度的药物,每孔挑入10只螨虫。将培养板放入测试环境(25oC，相对湿度为75%)，24h后镜检死亡情况。2.3统计分析根据机率值分析法，用Excel的卡方检验运算程序自动判断毒力回归方程的适合性与否[11]，计算出LT50和LC50。用SPSS12.0软件对试验数据进行多因素方差分析。3结果与分析3.1杀螨活性从表1中可以看出，100mg/mL的大蒜新素5min开始出现螨虫死亡，13min全部死亡，25mg/mL的阿维菌素5min开始出现螨虫死亡，17min螨虫全部死亡，可见100mg/mL的大蒜新素与25mg/mL的阿维菌素的杀螨活性差异显著（P0.05）。从表1中可以看出，相同浓度下的大蒜新素衍生物的完全杀死螨虫所需要的时间长于大蒜新素，大蒜新素与二丁烯三硫醚，二己烯三硫醚之间的差异显著（P0.05），与二戊烯三硫醚的差异不显著（P0.05）。二丁烯三硫醚、二戊烯三硫醚与阿维菌素的差异不显著（P0.05），与二己烯三硫醚的差异极显著（P0.01）。大蒜新素衍生物之间的差异显著（P0.05）。可见，100mg/mL大蒜新素与25mg/mL的阿维菌素杀螨活性相当，从图3中可以看出随着链的延长大蒜新素及其衍生物的杀螨时间呈现“N”规律变化。表1大蒜新素及其衍生物对兔痒螨的离体杀螨活性Table1AllicinandallicinderivativesfortheacaricidalactivityagainstPsoroptesCuniculiinvitro组别药物螨虫数开始死亡的时间/min全部死亡的时间/min药物组100mg/mL大蒜新素105±1dD13±2eD100mg/mL二丁烯三硫醚1010±1cC20±2cC100mg/mL二戊烯三硫醚107±1dCD15±2deCD100mg/mL二己烯三硫醚1020±2bB35±3bB阳性对照组25mg/mL阿维菌素105±1dD17±1cdCD阴性对照组101080±60aA2880±0aA同一列中右上角标有不同小写字母的数据之间差异显著(P0.05),标有不同大写字母的数据之间差异极显著(P0.01)。阴性对照组48h(2880min)内未完全死亡,全部杀死时间以2880min计。3.2半数致死时间的计算图1大蒜新素及其衍生物在不同时间的累计死亡率Figure1ThecumulativemortalityPsoroptesCuniculioftheallicinandallicinderivativesinthedifferenttimes从图1中可以看出大蒜新素及其衍生物对兔痒螨有很强的浸杀能力，在相同浓度下随着0204060801001200123456789时间h死亡率%大蒜新素二丁烯三硫醚二戊烯三硫醚二己烯三硫醚阴性对照组作用时间的延长，痒螨的死亡率增加。将死亡率转化为概率单位求得不同化合物的毒力回归方程可知，大蒜新素及其衍生物组中兔痒螨的死亡率与作用时间显著相关(r0.9840)，即大蒜新素的毒力与作用时间呈正相关,得出大蒜新素、二丁烯三硫醚、二戊烯三硫醚和二己烯三硫醚的LT50分别为0.6267、1.1036、0.8274和2.2308。大蒜新素及其衍生物之间的LT50存在极显著差异(P0.01)。阴性对照组无痒螨死亡。可见，20mg/mL的大蒜新素及其衍生物有较小的LT50,大蒜新素及其衍生物的的毒性比较大。从图3中可以看出随着碳链的延长LT50的数值呈现“N”变化。表2大蒜新素及其衍生物对兔痒螨的毒力（LT50）的几率值回归分析Table2Probitregressionanalysisoftoxicity（LT50）oftheAllicinandallicinderivativesPsoroptesCuniculiinvitro药品浓度mg/mL回归方程LT50/h卡方值χ2相关系数r大蒜新素20y=5.5181+2.5533x0.6267D0.00040.9999二丁烯三硫醚20y=4.9026+2.2738x1.1036B0.10080.9911二戊烯三硫醚20y=5.1675+2.0347x0.8274C0.14300.9968二己烯三硫醚20y=4.2856+2.0503x2.2308A0.15570.9840同一列中右上角标有不同大写字母的数据之间差异极显著(P0.01)。3.3半数致死浓度的计算图2不同浓度大蒜新素及其衍生物对兔痒螨的24h致死率Figure2ThemortalityofdifferentconcentrationsoftheallicinandallicinderivativesPsoroptesCuniculiafter24h010203040506070809010000.511.522.5浓度（mg/mL)死亡率%大蒜新素二丁烯三硫醚二戊烯三硫醚二己烯三硫醚从图2中可以看出大蒜新素及其衍生物随着浓度的增加，螨虫的死亡率增加。根据几率回归分析所得的毒力回归曲线可知，大蒜新素及其衍生物的浓度与螨虫的死亡率显著相关（r0.9581）,表明痒螨的死亡率与浓度间具有依赖性关系，表2。大蒜新素、二丁烯三硫醚、二戊烯三硫醚、二己烯三硫醚的LC50分别为0.6509、1.098、0.5330、1.2071。大蒜素新素及其衍生物之间的LC50差异极显著（P0.01）。阴性对照组无痒螨死亡。表3大蒜新素及其衍生物对离体兔痒螨毒力（LC50）的几率值回归分析Table3Probitregressionanalysisoftoxicity（LC50）oftheallicinandallicinderivativesPsoroptesCuniculiinvitro浓度mg/mL回归方程半数致死浓度/h卡方值χ2相关系数大蒜新素y=5.305x+1.63310.6509D0.23310.9914二丁烯三硫醚y=4.9315x+1.68411.0980B0.87940.9581二戊烯三硫醚y=5.4970x+1.81850.5330C1.19560.9633二己烯三硫醚y=4.8820x+1.44481.2071A0.48200.9688同一列中右上角标有不同大写字母的数据之间差异极显著(P0.01)。可见，大蒜新素及其衍生物有较小的LC50，大蒜新素及其衍生物对兔痒螨的效果好。从图3中可以看出随着碳链的增加LC50的变化呈现“N”样曲线变化。图3大蒜新素及其衍生物随着碳原子数的增加杀螨时间，LT50，LC50呈“N”样曲线规律变化Figure3Withincreasingthenumberofcarbonatoms,acaricidalactivity,LT50andLC50ofallicinanditsderivativesshow“N”changes.00.511.522.55678910111213碳原子个数LT50(h)LC50(mg/mL)杀螨的时间(min)4讨论4.1兔痒螨病是由痒螨科的螨虫主要寄生在兔耳部的一种慢性寄生性皮肤病，本病的特点是病死率低、感染率高、传播速度快，导致病兔生长发育缓慢，消瘦体弱，体重下降，机体抵抗力下降，饲料报酬降低，给养殖户造成很大的经济损失。试验结果表明，大蒜新素及其衍生物对兔痒螨很强的杀螨活性，其活性具有时间-浓度依赖性,大蒜新素及其衍生物具有速杀，高效的特点，100mg/mL的大蒜新素、二戊烯三硫醚与25mg/mL的阿维菌素之间差异不显著（P0.05）。4.2阿维菌素是近年研发的一种大环内酯类杀虫药，虽是一种低毒、高效的抗寄生虫药，具有很强的杀螨活性，但近年发现这类药在环境中残留会造成不良的生态影响，目前已经有螨虫对阿维菌素类药产生抗性的报道[12]。大蒜新素及其衍生物可以通过化学的方法合成，作为中药成分的大蒜新素具有毒性低、副作用少、残留低等优点，与目前广泛应用的生物杀虫剂阿维菌素的杀菌活性相当，因此，大蒜新素及其衍生物作为植物源的杀虫剂具有广阔的应用前景。至于大蒜新素及其衍生物能否作为杀螨剂还须进一步深入研究，杀螨的机理也还需要进一步研究。4.3试验结果看出，大蒜新素及其衍生物对痒螨作用快，毒性强，具有较小的半数致死时间（LT50）和半数致死浓度（LC50），从图3中可以看出随着碳链的延长对螨虫的LT50和LC50呈现“N”样曲线的变化规律。大蒜新素和二戊烯三硫醚的杀螨活性、LT50和LC50相似，二丁烯三硫醚的作用次之，二己烯三