模具基本結構簡介之兩板模

·275·国外医药抗生素分册2008年第29卷第6期过去几十年，以天然产物为基础研制和开发新药一直是化学界和医药界关注的重点领域。天然产物虽然在整个已知化合物中的比例很小，但以之为基础发展成为新药的比例却很大。根据2007年的统计，1981－2006年间国际上批准的药物中超过50%来源于天然产物、天然产物的衍生物或模拟天然产物药效基团的合成化合物。化学合成一直是增加化合物结构多样性的重要手段，根据天然产物自身的化学结构和生物活性等信息，组合化学合成又极大的丰富了化合物合成的数量[1]，但由于合成的目标化合物特异性不强，还没有给新药筛选带来所期望的亮点。天然产物的生物合成和组合生物合成研究进展王岩1，虞沂2，3，赵群飞2，孔毅1*，刘文2*（1.中国药科大学生命科学与技术学院，南京210009；2.中国科学院上海有机化学研究所生命有机国家重点实验室，上海200032；3.上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢重点实验室，上海200030）摘要：天然产物一直在药物的发现和发展过程中发挥着重要作用。化学合成作为增加天然产物结构多样性的传统方法，工艺繁杂。组合生物合成正逐渐成为药物研发的重点，与化学合成相比，其目标产物可以由重组菌株发酵大量生产，因而降低了生产成本和环境污染。本文综述了以生物合成为基础的组合生物合成研究策略，并以几种天然产物的研究为例介绍了相关的研究进展。关键词：天然产物；生物合成；组合生物合成中图分类号：TQ041文献标识码：A文章编号：1001-8571(2008)06-0275-08AdvanceinBiosynthesisandCombinatorialBiosynthesisofNaturalProductsWANGYan1，YUYi2,3，ZHAOQun-fei2，KONGYi1*，LIUWen2*(1.SchoolofLifeScience&Technology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China;2.StateKeyLaboratoryofBio-OrganicandNaturalProductChemistry,ShanghaiInstituteofOrganicChemistry,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200032,China;3.LaboratoryofMicrobialMetabolism,andSchoolofLifeScience&Biotechnology,ShanghaiJiaotongUniver-sity,Shanghai200030,China)Abstract:Naturalproductshaveplayedcriticalrolesinthedrugdiscoveryanddevelopment.Whileitremainsproblematictoeconomicallysynthesizenaturalproductsandgeneratetheiranalogsviachemicalroutesmainlyduetothecomplexstructures,combinatorialbiosynthesisisattractingmoreandmoreattentionsinbothacademicandindustrialfields,thetargetmoleculescanbeproducedbyarecombinantorganismthatisamenableforlarge-scalefermentation,therebyloweringtheproductioncostandreducingtheenvironmentalconcernsassociatedwithconventionalchemicalsyntheses.Thisarticlebrieflyintroducedtheprincipleandstrategyofcombinatorialbiosynthesis,highlightedbythebiosynthesisandmetabolicengineeringofafewpharmaceuticallyimportantnaturalproducts.Keywords:naturalproducts;biosynthesis;combinatorialbiosynthesis随着非典、禽流感、手足口病等新型疾病不断出现，多药耐药性、高耐药性病原菌在临床上日益多见，天然产物的发酵积累和活性鉴定等方面的压力加大，促使不少大型制药公司开始探索相对快捷的新方法[2]。在这种形势下，“组合生物合成”方法逐渐应用起来。虽然目前开展的有关组合生物合成的研究还局限于微生物来源的复杂天然产物，但应用该方法建立的化合物结构类似物库已经为筛选新药提供了更加广阔的空间[3-5]。天然产物在结构上的多样性是其生物活性多样化的基础，而化合物结构多样性的产生则来源于生物合成机制的多样化，组合生物合成就是从天然产物的生物合成机制出发，创造收稿日期：2008-09-01作者简介：王岩，硕士，主要从事*通讯作者：孔毅，[e-mail]；刘文，[e-mail]s,2008,Vol.29,No.6·276·“非天然”天然化合物的技术。本文主要概述了组合生物合成的研究策略以及几种天然产物的生物合成和组合生物合成的研究进展。1以生物合成为基础的组合生物合成研究策略组合生物合成通过对天然产物代谢途径的遗传控制来生物合成新型的复杂化合物：一方面，特异性地遗传修饰天然产物的生物合成途径，以此获得基因重组菌株，生产所需要的天然产物及其结构类似物；另一方面，将不同来源的天然产物生物合成基因进行重组，在微生物体内建立组合的新型代谢途径，由此重组微生物库所产生的新型天然产物构成了类似物库，有利于从中发现和发展更具有应用价值的药物(图1)。目前已报导的微生物天然产物有数千种，其中聚酮类(Polyketides)和非核糖体聚肽类(Non-RibosomalPolypeptides)占了相当大的比例，编码这些天然产物的基因通常特征性地成簇分布于染色体的某一区域而构成一个基因簇。聚酮或聚肽骨架的生物合成是以PKS或NRPS蛋白为模板、按照功能结构域和催化模块的排列顺序来指导化学结构的形成，这预示研究者们可以通过结构域和模块的功能重排构建重组的PKS或NRPS蛋白，从而控制聚酮或聚肽骨架结构的合成逻辑，以生产新型结构的“非天然”天然聚酮或聚肽化合物。例如，Menzella等利用模块间连接子和停泊蛋白将来源于8个聚酮生物合成基因簇的14个PKS模块组合成为154种含有双模块的PKS酶催化体系，其中近半数成功地在大肠埃希菌中合成了聚酮产物，这一快速的组合筛选模式有助于获得具有广泛底物适应性的结构域单元(如ACP和KS)，从而丰富组合生物合成研究的选择[6]。由PKSs，NRPSs或杂合PKS-NRPSs催化形成的聚酮或聚肽骨架赋予了化合物与特定靶点结合的刚性结构，但化合物生物活性的完全展现还要依赖于一系列合成后修饰(Post-SyntheticTailoring)，例如酰基化、羟基化、卤化和糖基化等，将这些后修饰基因重新组合可以影响化合物在微生物体内的生物合成，甚至产生大量结构衍生物。华东理工大学的Chen等通过增加红霉素生物合成基因簇中eryK(编码细胞色素P450羟化酶)和eryG(编码3-O-甲基转移酶)的拷贝数，提高了红霉素A的纯度和产量，降低了生产成本和工业污染[7]。2研究实例2.1阿弗菌素(PKS生物合成途径)阿弗菌素(avermectin)是由革兰阳性菌除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)产生的一类16元环大环内酯类抗生素，具有独特的生物活性，在医药、农业、畜牧业上有重要的应用。阿弗菌素类化合物包含了8种组分(图2)，以B1a最为有效。此外，该类化合物还包括其衍生物，比如应用价值更好的伊维菌素(ivermectin)和多拉克丁(doramectin)，前者将B1a的22-位和23-位双键换为单键，后者则将B1a的25-位侧链基团换为环己基。自1975年发现阿弗菌素以来，对其的研究主要集中在3个方面：阿弗菌素生物合成机制的探讨和阐述；选择性地提高B1a组分的比例和产量；与阿弗菌素相关的组合生物学研究等。随着除虫链霉菌MA24680全基因组序列的测定，图1组合生物合成的研究原理Figure1Principleandstrategyofcombinatorialbiosynthesis图2阿弗菌素的化学结构Figure2Chemicalstructuresofavermectins·277·国外医药抗生素分册2008年第29卷第6期图3阿弗菌素的生物合成基因簇Figure3GeneclustersofavermectinbiosynthesisOmura等运用染色体步移等技术鉴定了整个阿弗菌素生物合成基因簇，包含82.0kb染色体区域，共有18个开放阅读框(ORF)[8](图3)。其最显著的特点就是中间4个I型多功能聚酮合酶(PKS)结构的ORF，即aveA1-4，其编码的蛋白负责合成阿弗菌素的聚酮部分。通过与已报到的I型PKS结构比较后发现，编码阿弗菌素的PKS结构模块与西罗莫司(sirolimus,rapamycin)相似，它们同样分为几组并按2个相反的方向转录。位于PKS基因右侧的aveBⅠ~aveBⅧ编码的蛋白负责合成齐墩果糖和转糖基作用。PKS左侧的3个开放阅读框主要与最初合成的糖基修饰相关，aveD编码C-5-O-甲基转移酶，其活性需要S-腺苷甲硫氨酸(SAM)；aveF基因编码C-5酮还原酶，其在N末端有NAD(P)H结合基序。经过30多年的研究，阿弗菌素的生物合成机制已经基本阐明，但其调控途径和一些关键步骤还不清楚，基因簇中aveR和aveC的功能还不确定。aveR位于aveF的下游(但转录方向相反)，aveR突变株不能合成任何阿弗菌素，推测可能与其生物合成的正调控有关[8]。AveC位于aveA2和aveA3中间，可能决定阿弗菌素B2:B1的比例[9-10]。除虫链霉菌是一种重要的工业菌株，运用组合生物学的方法对其进行基因改造以提高阿弗菌素的产量一直是备受关注的领域。一方面，人们尝试提高菌株的生产能力。Hwang等将一段8.10kb的orfX基因(编码膜蛋白)转入野生型除虫链霉菌中，其结果是刺激了阿弗菌素的生物合成，使阿弗菌素的产量提高了近3.5倍[11]。天然产物在微生物体内的合成是一个复杂的过程，通常受到多重调控因素的影响。Uguru等在除草链霉菌NRRL8165中发现了阿弗菌素生物合成的负调控基因AveI；Chen等将野生型除虫链霉菌中AveI缺失后，发现阿维菌素B1a组分的产量提高了16倍[12]。另一方面，人们试图阻止无效组分或化合物(寡霉素等)的合成，引导代谢向B1a组分的生物合成方向发展。Schulman等使aveD基因(负责编码将B组分转化为A组分的甲基转移酶)突变，得到的产物只有B组分[13]；张晓琳等在此基础上通过同源双交换的方法将仅产生B组分的基因工程菌染色体上的寡霉素聚酮合酶基因簇(olmA)进行了缺失，得到不产寡霉素而仅产阿弗菌素B组分的基因工程菌[14]。自阿弗菌素被广泛应用以来，伊维菌素、多拉克丁和甲胺基阿弗菌素等生物活性高于阿弗菌素的结构类似物也逐渐被市场重视。多拉克丁的半衰期比阿弗菌素更长，但碍于基因工程菌产量太低而无法应用于工业生产。多拉克丁产生菌在体内代谢产生2种化合物：CHC-B1(多拉克丁)和CHC-B2(无效组分)，由aveC控制二者的生产比例。Stutzman-Engwall等通过增加野生型aveC拷贝数的方法增加CHC-B1的比例，但没有任何效果；随后研究人员又针对aveC基因进行了大量的随机突变