“创新实验”顺铂和阿霉素的浓度对细胞增殖产生的影响

创新实验论文探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素的浓度对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和凋亡产生的影响姓名：胡尔曼那力·艾力胡加学号：201111202924年级：2011级专业：生物科学探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素的浓度对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和凋亡产生的影响摘要：本实验主要探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素对HeLa细胞增殖及凋亡的影响，HeLa细胞是一种癌细胞，增殖速度快，通过探究其药物的浓度对癌细胞的抑制及其凋亡情况，可以利用药物有效地控制细胞的增殖并使细胞致死。通过MTT比色法对HeLa细胞进行生长曲线的测定，观察细胞的生长情况。在生长曲线上找出相应的IC50的值，并且比较不同浓度下的IC50的值，即可知道药物的浓度对细胞增殖所造成的影响。通过流式细胞术实验方法测出细胞的凋亡比例及各个周期时相的百分比即可知道不同药物对于HeLa细胞凋亡的影响。前言：细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以细胞分裂的方式进行增殖。通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞如果增殖异常如无限地增殖，将会导致生物体的正常生命功能受阻，如肿瘤的发生。细胞死亡也是生物体的重要生命活动之一。多细胞生物发育过程中，在细胞增殖和分化的同时一些细胞被选择性地消除，以形成组织、器官和四肢，而且在整个生命进程中，细胞的死亡与新细胞的产生之间的动态平衡对于维持组织和器官的正常功能具有重要作用。因此，细胞死亡调控的异常与帕金森症、自身免疫性疾和癌症等疾病的发生和发展密切相关。癌症是威胁人类健康的最严重的疾病之一，并呈不断上升趋势。目前用于癌症治疗的主要手段有手术、放疗、化疗和生物治疗。肿瘤化学治疗是应用一种或数种化学药物，通过口服或注射达到治疗肿瘤的方法。不同肿瘤的化疗效果差别很大，手术前后的合理化疗，有助于提高疗效。目前发现许多天然药物具有抗肿瘤作用。其中很多抗肿瘤药物可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞的毒副作用较小。如顺铂、阿霉素、喜树碱、顺铂、阿糖胞苷、放线菌酮、环磷酰胺。这些药物均可以抑制肿瘤细胞的增殖，并且目前有不错的效果。关键词：顺铂阿霉素HeLa细胞细胞增殖细胞凋亡1实验原理1.1HeLa细胞HeLa细胞是源自一名美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞。HeLa细胞株是由正常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒（HumanPapillomavirus18或HPV18）转型成癌细胞的HeLa细胞至今已被视为“不死的”，也就是说此细胞株（不同于其他人类细胞）不会老死，而且可以不限次数的分裂下去，而且已培养出一个不间断的系列。从1951年至今，HeLa细胞已经培养了50多年，分裂了18000次以上仍然没有停止的迹象。此细胞株即使和其他癌细胞相比，增殖依然异常迅速。1.2顺铂和阿霉素顺铂（顺氯氨铂，cisplatin,DDP）将所含之氯解离，然后与DNA上的核碱鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶形成DNA单链内两点的交叉联结，也可能形成双链间的交叉联结，从而破坏DNA的结构和功能。对RNA和蛋白质合品属细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌作用。临床用于卵巢癌、癌前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显示疗效。成的抑制作用较弱。属周期非特异性药物。阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成来杀灭癌细胞。盐酸阿霉素对机体产生广泛的生物化学效应。具有强烈的细胞毒性作用。其作用机制主要是阿霉分子嵌入DNA而抑制核酸的合成。1.3PI和Ho.33342PI（碘化丙啶）：双链核酸标记物，亲水性，不能通过完整细胞膜，激发光谱和发射光谱分别为535nm和617nm，激发光波长范围较宽，从紫光到绿光均可作为激发光。Ho.33342：特异结合AT区的DNA标记物，亲脂性，激发光谱和发射光谱分别为350nm和461nm细胞类型膜完整性染色质凝集程度凋亡小体的形成PI染色Ho.33342正常细胞完整不凝集无无法透过蓝色凋亡细胞完整高度凝集有无法透过蓝色坏死细胞破损一定程度的凝集无橘红色蓝色（同时染PI被橘红色遮掩）1.4MTT比色法MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。1.5IC50IC50是指细胞被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应，抗原抗体反应等。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低，当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。2.实验步骤2.1利用MTT法检测细胞增殖1、取对数生长期的细胞,用胰酶消化计数,配制细胞悬液浓度为4x104/mL，取细胞接种到96孔板，每孔200μL，8000细胞/孔。2、加药处理:•（1）24小时后，待细胞贴壁后吸取培养基200μL，弃除，调零孔不作处理。•（2）设置药物浓度分别为1x10-3μg/μL、2x10-3μg/μL、4x10-3μg/μL、6x10-3μg/μL、8x10-3μg/μL,对应按每列分别加入Cc1、C2、C4、C6、C8(顺铂组)，Cd1、D2、D4、D6、D8（阿霉素组）列中。96孔板上药物分布如表1所示：••（3）配置浓度梯度及加药方法：•药物母液浓度为5mg/mL，即5μg/μL，顺铂溶于DMSO，盐酸阿霉素溶于水。分别取0.4mL顺铂/阿霉素，加入1.6mLDMSO/水，混合均匀，得到1μg/μL的顺铂及阿霉素溶液。顺铂与阿霉素的浓度梯度配置方法相同。•取药物2/4/8/12/16μL,对应加入14/12/8/4/0μLDMSO/水（药物为顺铂即加DMSO，药物为阿霉素即加水），各加入2mL培养基，即配制出浓度分别为为1x10^-3μg/μL、2x10^-3μg/μL、4x10^-3μg/μL、6x10^-3μg/μL、8x10^-3μg/μL的药物。两种药物不同浓度分别相应加入Cc1、C2、C4、C6、C8(顺铂组)，Cd1、D2、D4、D6、D8（阿霉素组）列中，每孔200μL。取培养基2mL，分别加入16μLDMSO/水，混合均匀，加入到对照1/对照2列中，每孔200μL。3、测定:取测定孔,弃去培养基,加100μL新鲜的培养基,加12μLMTT，4小时后加100μL裂解液。过夜后，用酶标仪测定OD值。4、根据测得OD值，用SPSS软件进行分析，求出以对照组吸光度OD值减少一半所需的药物浓度IC50，即半数抑制浓度。2.2细胞的形态学观察•1、取生长到80-90%融汇度，对数生长期的细胞，按1：4比例传代。取1瓶细胞传到4瓶。•2、按求得的顺铂及阿霉素浓度在传代的第二天，向培养基中加入药物或对照溶液。弃除细胞培养瓶中原培养液，加入5mL新培养基。分别取浓度为5mg/mL的顺铂及阿霉素母液，其中顺铂7μL，阿霉素4μL各加入细胞培养瓶中。对照组分别取DMSO7μL，水μL各加入细胞培养瓶中。3、48-72小时后，收集培养液，用胰酶适度消化细胞，用收集的培液吹打细胞，将分散成单个的细胞悬液收集至10mL离心管中，1000rpm,离心15min去上清，用0.2毫升PBS重悬细胞•4、取200μlPBS细胞悬液，加入PI20μL（终浓度100μg/ml），Ho.333422μL（终浓度10μg/ml），混匀，37度温箱中避光标记15min。(带手套操作）•5、1000rpm，离心10min，弃上清，加10-50μLPBS重悬，取10μL滴于载玻片上，盖片（不能有气泡或漂起），保存于暗处。6、荧光显微镜观察拍照（紫外激发）。3．实验结果3.1MTT法实验结果顺铂的实验结果：分析：由MTT实验结果可看出，可能会出现波动较大的数据，计算IC50时应将这些数据舍去。根据所测OD值可算出顺铂对BGC-823细胞的IC50值为5.698左右。但数值波动较大，实验结果不稳定，综合全班实验可知顺铂的添加浓度约为7。阿霉素的实验结果分析：由MTT实验结果可看出，可能会出现波动较大的数据，计算IC50时应将这些数据舍去。根据所测OD值可算出顺铂对BGC-823细胞的IC50值为3.054左右。但数值波动较大，实验结果不稳定，综合全班实验可知顺铂的添加浓度约为4。3.2顺铂和阿霉素对人宫颈癌细胞HeLa细胞凋亡的影响的形态学观察图一为Ho.333422和PI染料双染HeLa细胞得到的细胞核形态图。从图中观察可以看到有呈蓝色的细胞，也有呈红色的细胞。图一中的A、B代表未加顺铂和阿霉素的空白对照。C为加入顺铂的HeLa细胞的细胞核形态图，D为加入阿霉素的HeLa细胞的细胞核形态图。ABCD图一Ho.333422-PI双染观察凋亡细胞的形态从图一中可以看出，对照组A、B的细胞数目要明显多于实验组C、D的细胞数目。C、D实验组加入了顺铂和阿霉素，由此说明顺铂和阿霉素确实对于细胞的生长具有抑制作用。当比较A、C两组的时候发现，对照组基本上没有出现凋亡细胞；分别观察两个视野可以发现，加药组出现了部分凋亡细胞。从细胞凋亡形态观察结果可看到，视野中的坏死细胞较多，可能因为实验操作不够轻柔，从而导致细胞坏死；也可能是在用胰酶消化细胞消化过度而引起的细胞坏死。因此实验时要注意以上两点。当BD两组相比较可发现对照组基本上没有出现凋亡细胞；分别观察两个视野可以发现，加药组出现了部分凋亡细胞（一个视野中有4个，另一个视野中有2个）。从细胞凋亡形态观察结果可看到，视野中有少量坏死细胞，可能因为实验操作不够轻柔，从而导致细胞坏死；也可能是在用胰酶消化细胞消化过度而引起的细胞坏死。因此实验时要注意以上两点。有上述的比较还可以知道，顺铂和阿霉素可以促进细胞的凋亡。4.实验总结综合上面所述的三个结果分析，顺铂和阿霉素都对HeLa细胞的增殖具有一定的抑制作用。5.实验注意事项1、整个实验期间注意无菌操作，注意细胞保种，发现细胞污染时要及早采取补救措施2、做MTT时，加药顺序和处理时间要标记清楚不能弄混。3、每天加MTT和裂解液时，要在调零用的孔中进行相同操作。4、细胞传代要每天观察，及时传代。5、每天操作时，要在显微镜下观察细胞生长状态，看是否有污染。6、染色要避光染色。6.实验思考题肿瘤细胞和正常细胞在增殖调控上有什么区别？参考文献[1]百度百科[2]老师编的实验指导书[3]老师的PPT