Westernblot

Westernblot一、Westernblot历史及原理蛋白质印迹(Westernblotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，简称WB。1975年，继EdwinSouthern发明的“SouthernBlot”，1977年GeorgeStark及其同事发明的“NorthernBlot”技术之后，受以上两个“转印”技术的启示，1981年“WesternBlot”这一技术正式问世。抗体技术的发展，电泳及转膜技术的改进使得WesternBlot操作日益简单；分析方法及工具多样化、成像技术的革新、高灵敏度示标信号的出现使得WesternBlot的检测范围得到扩展，定量/半定量成为可能。目前WesternBlot设备不断更新、技术不断发展，WB仍将在较长时间和应用领域内得到更加广泛的应用，其检测灵敏度也将不断提高。其基本原理与ELISA相似：通过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离混合蛋白质样品，转印到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以转印到固相载体上的蛋白质（多肽）作为抗原，与对应的抗体（又称一抗）特异性结合，特异性抗体再与酶、荧光素或同位素标记的抗一抗抗体（又称二抗）起反应，经过底物显色或放射自显影以检测样品中特异性蛋白（见图1）。一抗的质量是WB成功的关键，现在市面上抗体公司很多，一般选择大公司大品牌的抗体对于实验的成功很有保证。但是由于实验经费的限制只能选择小公司或国产二线品牌的抗体，这个时候需要使用者尽可能多考究：①完整的质检数据；②售后承诺；③技术人员对产品的熟悉程度。对于二抗来说，选择就更需谨慎，虽然二抗看似简单，其质量却千差万别，对实验结果的影响也尤为重要。福因德科技（Frdbio）专注于免疫检测产品的开发和工艺研究，只做精品；如果客户购买的产品质量达不到标明的水平，无条件退货。对于WB的底物是根据二抗的标记酶来确定的，有大家较为熟悉的辣根过氧化物酶HRP（HorseradishPeroxidase，）和碱性磷酸酶AP（AlkalinePhosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（GlucoseOxidase）、β半乳糖苷酶β-Galactosidase，不同的酶对应的底物当然也不同，并且底物被催化后应该是不扩散不溶解的图1.Westernblot原理示意图Westernblot的主要流程如下：样品制备总蛋白质的定量SDS-PAGE电泳转膜封闭一抗孵育二抗孵育加底物，显色/显影，定影/化学发光，下面将对这些步骤详细介绍。二、Westernblot操作流程在熟悉原理之后实验人员可以根据操作流程轻松开展实验，下面主要介绍关于Westernblot的主要操作流程。⒈样品制备：⑴动物细胞总蛋白的提取：细胞都含有一个保护细胞不受外界环境干扰的细胞质膜，细胞质膜主要由磷-脂双分子层组成。两性的脂质形成的等离子体膜在具有亲水基团的同时也含有疏水性基团，从而自发的形成一个封闭的双分子层壁。膜蛋白嵌入在脂质双分子层,横跨疏水区，也就是说细胞膜主要由脂质和蛋白质组成，但其各成分的比例则是随细胞类型及生物种属的不同而对应变化。实验中提取细胞蛋白用到的裂解液中含有的表面活性剂如Triton-100、NP-40、SDS等，能够插入并破坏细胞膜的磷脂双分子层，从而达到细胞裂解的目的。这一类裂解液商品化的有很多，比如福因德科技研制的Western及IP细胞裂解液（Frdbio,CatNo.WBR0105）、RIPA裂解液（Frdbio,CatNo.WBR0103）、NP-40裂解液（Frdbio,CatNo.WBR0104）等。在蛋白提取过程中尽量冰上操作以防止蛋白降解，也可适量加入蛋白酶抑制剂PMSF，福因德科技(Frdbio)可提供效果较好的蛋白酶抑制剂（Frdbio,CatNo.WBR0114）。对于加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除收集贴壁细胞外还应收集培养液中的细胞。⑵细菌及植物组织总蛋白的提取：对于动物细胞来说质膜是其唯一的保护屏障，但是在植物细胞和细菌的质膜外还有一层坚硬的细胞壁存在。细菌的细胞壁主要由肽聚糖组成，由n-乙酰葡萄糖胺和n-乙酰胞酸两种氨基糖经β-1.4糖苷键连接间隔排列形成的多糖支架。而溶菌酶可以水解这一糖苷键从而达到裂解细胞的目的。对于细菌的裂解可以用含有一定浓度溶菌酶的PBS缓冲液（TE,pH8.0）即可。而植物细胞壁主要由纤维素和果胶组成的，这为植物细胞赋予了细胞形状和刚度。对于植物组织蛋白的提取目前多用机械破坏法如液氮研磨或化学法如三氯醋酸-丙酮沉淀法或TCA丙酮沉淀法；⑶对于需要提取特殊亚细胞结构的蛋白如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白、细胞膜蛋白等，由于操作比较麻烦，可以选用商业化的试剂盒，例如福因德科技(Frdbio)研制的核蛋白提取试剂盒（Frdbio,CatNo.WBR0106）与线粒体蛋白提取试剂盒（Frdbio,CatNo.WBR0109）、细胞浆蛋白提取试剂盒（Frdbio,CatNo.WBR0108）。⒉总蛋白质的定量：提取样品的总蛋白后需要对提取的蛋白作定量分析，以便于电泳时上样量的把握。目前蛋白定量主要有Lowry法、BCA法（Frdbio,CatNo.WBR0202）、沉淀法、Bradford法（Frdbio,CatNo.WBR0204）等，任何定量都需要选一个标准蛋白作为定量依据，绘制标准曲线，常用的且方便可靠的就是BSA（牛血清蛋白）。⑴制作标准曲线一般选用BSA来制作标准曲线，作为定量标准用的BSA（Frdbio,CatNo.WBR0205），其纯度和理化性质必须相当的标准。配制一定浓度的BSA标准溶液，按需求进行梯度稀释，然后根据各种定量方法测定器数值，绘制标准曲线。福因德科技（Frdbio）有作为定量专用的BSA溶液提供（Frdbio,CatNo.WBE0205），商业化的蛋白定量测定试剂盒中都有标准BSA配置。⑵蛋白含量的测定蛋白含量测定的方法有多种，例如Lowry法、BCA法、沉淀法、Bradford法，但目前相对于另外两个来说BCA法和Bradford法使用较多。在裂解细胞时使用的裂解液若是Western及IP细胞裂解液（Frdbio,CatNo.WBR0105）、RIPA裂解液（Frdbio,CatNo.WBR0103）、NP-40裂解液（Frdbio,CatNo.WBR0104）等，则可选用福因德科技（Frdbio）的BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（Frdbio,CatNo.WBR0202）、BCA蛋白定量试剂盒（Frdbio,CatNo.WBR0201）或Bradford蛋白浓度测定试剂盒（Frdbio,CatNo.WBR0204）搭配使用，但不同的试剂盒测定精确度不同，可根据实验需要进行选择，客户可根据实际需要登陆我们网站查询相关产品说明书。⒊SDS-PAGE电泳⑴制样上样总体积一般不超过15μl，上样前将样品与上样缓冲液按要求混合后沸水中煮5min使蛋白变性后立即冰浴。一般使用的是5×上样缓冲液和2×上样缓冲液，5×上样缓冲液的配置方法是：250mMTris-HCl(pH6.8)、10%(W/V)SDS、0.5%(W/V)、0.5%(W/V)溴酚蓝、50%(V/V)甘油、5%(W/V)β-巯基乙醇。2×上样缓冲液的则在5×的基础上各含量减半。为节约科研工作者的时间和精力，可选择福因德科技（Frdbio）的商品化上样缓冲液，可选择5×的蛋白上样缓冲液（Frdbio,CatNo.WBR0304A）和2×的上样缓冲液（Frdbio,CatNo.WBR0304B）。⑵制胶聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(APS)，N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，具有分子筛效应。它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）,没有加变性剂如SDS，电泳过程中蛋白质保持完整的天然状态，蛋白在其中依三种因素进行分离：蛋白大小，结构和电荷；另外一种是变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）,在样品和凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白的二、三级结构被破坏，加入的SDS与蛋白结合后使得蛋白带有很强的负电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，最终蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小和凝胶分子孔径排阻效应。对于待检蛋白活性有较高要求的实验中，一般选用Native-PAGE，因为非变性胶在分离蛋白后对蛋白的活性并没有明显的影响，例如EMSA。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时，要用低pH凝胶系统，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。分离酸性蛋白时候，要利用高pH（8.8）凝胶系统，蛋白会带负电荷向阳极移动，SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，由浓缩胶（上层胶）和分离胶（下层胶）组成，当电泳开始后，电泳开始时缓冲液中的氯离子泳动最快,甘氨酸根离子最慢，因此在中间形成低电导区，使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一个狭窄的区带。在进入分离胶后蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的大小移动，从而达到分离蛋白的目的。蛋白分子量不同，所适用生物SDS-PAGE浓度也会对应不同，下表是聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）和对应的蛋白质分离范围（kD）聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）有效分离范围（kD）650～150830～901020～801212～601510～40配制的凝胶质量对电泳条带的清晰度以及背景有着密切的影响，灌胶前玻璃板一定要洗干净并且用吸水纸擦干；灌胶时不能有气泡；凝胶要彻底才能点样电泳。另外制胶的药品丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在溶解后有毒，因此在制胶过程中一定要小心，注意安全。现在为方便科研工作者，已经有商业化的SDS-PAGE凝胶试剂盒，例如福因德科技（Frdbio）的SDS-PAGE凝胶试剂盒（Frdbio,CatNo.WBR0401）。⑶电泳当样品处在浓缩胶中时电压不宜过高，可将电压调在80V，在电泳大概30min左右，蛋白进入分离胶中，此时可稍微调高电压至120V。电泳过程中由于系统会产热，为得到较好的结果电压不宜过高，但是为节约时间也不能太低，以上是经过实验总结出的较好的电压选择。为方便观察电泳效果和转膜效果以及判断蛋白分子量大小，最好使用彩色预染蛋白分子量标准（Frdbio,CatNo.WBR0501B）。蛋白迁移不仅与蛋白自身性质以及PAGE凝胶有关，与电泳液也有一定的关系。电泳液的离子强度，pH等都会影响蛋白的迁移。电泳液可以选择使用福因德科技（Frdbio）生产的SDS-PAGE电泳液（Frdbio,CatNo.WBR0301）。⒋转膜将凝胶分离的蛋白从凝胶转移到膜上，目前方法有很多，比如溶移印相法、毛细管转移法、热对流转移法、真空印迹转移法、电转移法等，电转移法由于其快速性及高效性一直备受科研工作者的青睐。转膜的原理与电泳相同，蛋白与SDS结合形成复合体带负电，在正负电场作用下，蛋白从凝胶中转印到膜上。由于膜对蛋白的吸附作用很强，同时由于甲醇的固定作用，所以转移到膜上的蛋白也不会轻易穿透膜“跑出去”，但是对于小分子量的蛋白质还是很容易透过膜的孔径“穿透”出去。所以对于小分子量的蛋白质的转印，转印时间不宜太长。转膜仪的红色代表正极，黑色代表负极，组装时先把湿润的海绵和滤纸依次铺在负极上，再铺上凝胶，随后是膜，接着是滤纸和海绵，形成“三明治”结构（见图2）。注意在铺凝胶和膜的时候一定要注意不能有气泡，尽量用玻璃棒除掉所有气泡。图2.湿转转膜“三明治”结构半干转的原理与湿转是一样的，是将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷。在电转仪上铺3层湿润的滤纸，再将膜铺在先铺滤纸上，注意和滤纸