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1．GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。广泛用作Westernblot蛋白质标准化的内参。WesternBlotting检测条带大约在36kDa2．我的目的蛋白有200kd左右，beta-actin只有47kd，目的蛋白条带出现时，beta-actin会跑出pvdf膜。如果做两块胶，一块跑目的蛋白，一块跑beta-actin，不是很严谨啊？3．用B-actin做内参在上样量超过20ug时就没有意义了，我的蛋白经浓缩后上样已经到500ug了.....4．我一直做210KD的，用6%分离，5%浓缩，大概电泳跑100MIN，不要等嗅芬兰到底~蛋白就跑的位置很好了，然后转100V，150MIN提高高分子量蛋白转移效果有以下几种方法：甲醇在其中的作用是增加蛋白与膜结合的能力，可增加转移时间，防止胶变形，但其可降低高分子量蛋白的转移效率，个人认为可适当加10%-15%的甲醇，既增加蛋白的结合，对转移效率影响也不大。另可加入终浓度0.1%SDS，其可增加转移效率，但与甲醇作用相反，可减少蛋白与膜结合的能力。总之，你可甲醇和SDS都适当加点，低浓度，我们一直这么做的，转移200KD左右的蛋白都没问题。我是6%的胶，转膜用的是恒电流，25mA，3小时.transferbuffer:Gly75g,Tris30.2g,配成5倍体,用时在稀释并加入20%甲醇5．BIO有预染MARKER，最高是210KD6．我用的是5.4%的胶，电泳：基层胶60mv40min；分离胶120mv50min；转膜湿转120mv2.5h，牛奶封面2小时，一抗（1：400）4度过夜，洗膜5min×3次；二抗常温1h，洗膜15min×3次7．不分正反面，转膜的时候需要做个标记，这个标记是用来记住你的样品对应的位置。8．我做的２００ＫＤ的，我的考染和丽春红染都非常清楚，可惜手头上没有图．注意点：１、提蛋白的时候加点ＰＭＳＦ或着COCKTAIL，应该不会降解。２、如果是膜蛋白或者是核蛋白，超声可以获得更高质量和丰度的蛋白。３、如果你的蛋白由几个亚基构成，煮沸变性后可能会导致亚基分离，分子量变小．但是一般不会影响总蛋白的质量9．大分子量蛋白建议用恒定的大电流，400MA，2h。如果蛋白没有降解，肯定可以转上的。这个条件需要注意降温，不能使转膜液过热，除了在转膜槽中加冰袋，最好将转膜槽置于冰水中，上面盖上足够的冰块。我用的是bio－rad的仪器。10．我做过210kd的，100v15min后换为130v2h，条带很不错11．我曾经做过130－230KD的转膜，用60mA转膜过夜（10小时－15小时左右），用BioRad的小槽，转印的膜为一整张PAGE胶那么大，效果比较好。你如果认为是夹板松了可以将滤纸加厚一点。如果怀疑是转印时间太长，你可以在正极加上两层PVDF膜。你要看看你的转印缓冲液前后两次是否一样，新的缓冲液转印效率要比旧的高不少。12．我跑过200KD的蛋白，用的条件是恒压110V，时间是3小时13．我关于蛋白转膜的一点体会,转膜夹一定要加紧,PVDF膜甲醇处理30秒足够了,用双蒸水洗涤2分钟后,放于转膜液中,保证PVDF膜变透明,甲醇你可以用10%的,我跑过大分子量的蛋白,结果还好,转膜条件400ma,90min-120min足够了,国产普通滤纸两层就可以了,转膜后要晾干PVDF膜,切记不能太干,否则蛋白会丢失.14．15．主要原因还是时间短，分子量太大。可加大时间要是还不行的话电转液里面不要加甲醇，或少加16．我以前做过3，4个这种大分子的蛋白，感觉转膜很关键我是湿转，NC膜，电转液含20％甲醇，不含SDS恒压200V6小时17．1.转膜时间太短，我们科的转膜传统恒流80mA，我只知道一个师姐做过250KD的，80mA转7-8h。2.大分子量的应该加SDS。3.甲醇可降低到15%4.“5%牛奶室温封闭2h，一抗CST的，1：1000，4度过夜，37度2h，二抗1：5000.37度2h.”如果抗体是封闭液配的，可以不封闭试试。一抗都过夜了，还有必要37度2h嘛？抗体也并非时间越长越好！4度10——12h差不多了吧我做的条件是二抗25度1h比37度的效果好。5.不同实验条件结果可能相差很大，刚开始做实验可以摸个抗体滴度。试着提高一抗，如果都是4度的话，好出的蛋白（例如actin，我用过5次依然出的很好）可以多用几次。6.抗体要与膜充分接触如果以上都不能解决，试着适当延长洗膜时间，特别是二抗。有一次ECL显色第一次没出，就把膜放在那接着洗，吃晚饭回来了再撒些显色液就出了。18．230KD.湿转，恒压100V(但是电流保证在140~200mA，各种转膜缓冲液不同，电流不同，转膜时间久了电流也不同，仪器不同电流也不同，只要在这范围)90min，就够了.从来没有失手过。19．20．21．最好先跑个电泳看看,蛋白质能否通过5%分离胶,如果可以就可以进行转膜.转膜条件:80V,3个小时22．我用bio-rad湿转120min100V，结果还可以。我转的是non-musclemyosinchain2A(220kDa)你的分子量这么大，不应该这么转的，最好是低电流转过夜（12个小时以上！），6％的胶够稀的了，不需要再稀了，否则还不一碰就碎了（）用30mA，转16小时以上，用8％的胶也可以。，问了一下科室的老师他推荐200mA转5－6个小时（4度），不知道和30ma转16个小时哪个更好点？[主要试剂]4.提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径?聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。如果在胞内或机体内发生的proteindegradation,是一种生理或病理现象，体内的所有蛋白每天都在进行着从合成——降解的循环。这种胞内降解，不会影响你2DE蛋白样品的提取质量，也不会是一个同一时间，大多数蛋白同时降解的现象。这也就是ＬＺ所谓的提蛋白之前的降解。而蛋白样品提取和保存的过程中，由于操作不当，会导致蛋白样品的降解，这必然是在提蛋白过程中或之后了。蛋白样品降解的主要原因包括：１。操作过程或样品提取过程温度过高（未在４度进行）或时间过长２。裂解液中无蛋白酶抑制剂３。蛋白长时间保存于室温、４度或－２０度（建议－７０度或液氮）４。蛋白反复冻融等等。如果注意了以上几点，蛋白样品在提取后，一般是不太容易降解的。这个只能大致说是30ug-70ug/孔了，这个量只是总蛋白量，只能参考大分子量蛋白不加甲醇，因为大家用的膜都是0。46um孔径的，甲醇虽然可以帮助蛋白向膜转移，但是其容易在膜上的微孔上引起还原反应，妨碍大分子蛋白质与膜的结合。但是SDS可以帮助大分子蛋白向膜转移，故转移缓冲液中可不加甲醇，增加SDS.提高高分子量蛋白转移效果有以下几种方法：甲醇在其中的作用是增加蛋白与膜结合的能力，可增加转移时间，防止胶变形，但其可降低高分子量蛋白的转移效率，个人认为可适当加10%-15%的甲醇，既增加蛋白的结合，对转移效率影响也不大。另可加入终浓度0.1%SDS，其可增加转移效率，但与甲醇作用相反，可减少蛋白与膜结合的能力。总之，你可甲醇和SDS都适当加点，低浓度，我们一直这么做的，转移200KD左右的蛋白都没问题。SDS主要通过疏水作用与蛋白结合,一定的SDS单体浓度下,大约结合比例为1.4gSDS/1g蛋白(引自PNAS,1970,66,1002-1007,作者是Reynolds),而巯基乙醇使蛋白二硫键还原,有利于蛋白质与SDS的结合,蛋白样品被加热变性能使SDS与蛋白充分结合.westernblot要得以进行，特别是抗体要和目的蛋白结合，一方面要使打开蛋白质的SS键，因为如果SS键不打开，很有可能抗体不能很好的识别特定的位点，就不能结合上去；另一方面还要用SDS-PAGE消除蛋白质分子内的各种非共价键，使蛋白质所带电荷和其分子量成正比，这样才能使蛋白质分离出来。DTT在电泳中还有一个作用。过量DTT能打开多聚体内的二硫键，使呈各个单体状态，而在loading中去除DTT后，多聚体仍然保持原状态。因此两者对比可以分辨该蛋白是否含有多聚体形式。SDS-PAGE（SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.