western步骤

一。提蛋白配RIPA(10ml配方)RIPA9mlPMSF（100mM）100ul10xcocktail1ml组织剪碎，组织：RIPA=1：5~1:10，或裂解液500ul。匀浆（过程中每个组织匀浆完清洗，夹出碎组织）。冰上静置40min-1h，4℃12000rpm离心10min-15min。取上清转移到新离心管内。如不马上进行定量变性的话，-20℃保存，最好1周内进行变性。BCA蛋白定量与蛋白变性配BCA液：A液：B液=50:1。蛋白样品置于冰上。每孔加5ul蛋白样本（组织样品稀释10倍，2ul组织蛋白样品+18ulRIPA）与100ulBCA液。标准蛋白与样品蛋白全部加3个孔。先加蛋白，再加BCA液，加BCA液速度尽量快，保证每孔反应时间相近。37℃摇床30min，酶标仪读数。设置波长562nm，标准蛋白浓度mg/ml（2，1.5,1,0.75,0.5,0.25,0.125，0.025,0）。根据读数计算蛋白浓度，稀释。一般稀释到1ug/ul或2ug/ul。配200ul稀释蛋白+50ul5xloadingbuffer（有剧毒，臭味，不要沾手上）。混匀，99℃煮10min。-20℃保存。电泳胶板固定，检查胶板是否放平，加水检查是否漏水。放入电泳槽内。胶板内加新电泳液加满，胶板外可加回收电泳液，胶板外电泳液液面至少摸过胶板下缘。拔梳子，垂直，轻。上样：marker上两端，1ul-2.5ul均可。蛋白上样15ul-25ul（根据实际情况决定），加蛋白过程要轻柔一些，不要把蛋白吹起溅落到相邻孔内。加完蛋白后再补足新电泳液至溢出。80V电压跑到marker分开（可以看到红色条带）。此时可加大电压至100V或120V，也可80V跑完。BKα大小110KD左右，GAPDH36KD，β-Actin42KD。蛋白跑到目的条带大小的marker位置与内参大小的marker位置完全分开就可以停止电泳了（至少要能分开35KD和40KD的条带）。电转：电转液提前放置冰箱（时间比较长放4度，时间较短的话放-20℃）。每板胶剪6张滤纸，1张膜（PVDF膜使用前甲醇浸泡10s再浸入电转液，NC膜直接泡电转液）。大小膜滤纸胶，防止两端滤纸直接接触造成短路。取胶：翘起胶板，切掉浓缩胶与分离胶蓝紫色以下部分（可以切角区分两板胶），放置于电转液内浸泡。放置顺序（所有均用电转液浸泡）：黑板–海绵–三层滤纸–胶--膜–三层滤纸–海绵–白板。放入电转槽，黑板对黑面，白板对红面。电泳槽浸入冰内。槽内放冰盒。1.5mm胶300mA120min（80min+40min，中间换冰盒）。1mm胶300mA90min（65min+25min，中间换冰）。取出膜，5%TBST脱脂奶粉封闭1h（常温摇床）。膜置于保鲜膜上，按蛋白marker大小切膜（切的时候要稍微多切一些，留出一定余地，因为marker并不是完全准确的）。拿一个自封袋，切三边，留一边，塑封机塑封做出密封口，加入相对应一抗，挤出气泡，封口。4℃过夜。第二天冰箱取出膜，常温摇床30min，TBST10minx3遍。二抗2ul+10ml1%TBST脱脂奶粉，常温摇床1hTBST10minx3遍，TBS10minx2遍配发光液，避光（拿锡箔纸包住管），A液：B液=1:1。切好的4张膜配1ml（A液500ul，B液500ul）左右。曝光，设置曝光时间，拍照数。发光液要先与膜接触1min再开始曝光程序。