工业微生物发酵过程放大策略

SPECIALFEATURE工业微生物发酵过程放大策略储　炬　杭海峰　庄英萍（国家生化工程技术研究中心，上海，200237）dio:10.3969/j.issn.1674-0319.2009.04.006生物过程设计可以分为三个基本阶段①：首先，运用各种基因和代谢工程工具对高产菌种进行初筛；其次，对初筛得到的高产菌种进行培养条件的优化，以实现高产；最后，对培养过程进行放大，在稳定、可控的大规模培养过程中实现高产目标。生物过程的放大是发酵工程中的重要研究内容，研究不同规模生物反应器中的培养过程特性。与生物工程学科中其他一些新兴研究领域，如各种组学（包括基因组、转录组、蛋白质组、代谢物组等）以及代谢工程相比，发酵工程的研究是比较成熟的，同时，在生物反应器的特性认识以及设计中，如果能结合细胞的生理特性进行研究，将会使发酵过程及其放大取得更好的结果。1　生物过程放大技术研究进展作为生化工程领域的重要问题，生物过程的放大（scale-up）早在20世纪40～50年代的青霉素工业化生产中就进行了研究，同时，由于工业化大规模生产需要解决纯种培养技术和液体深层培养时的供氧问题，因此在放大过程中，供氧问题很早就成为生物过程放大的研究重点，例如Jensen等②研究了通过控制氧的利用率来进行抗生素发酵的放大。几十年来，随着生化工程学科的发展，研究人员对不同培养方式下的放大问题进行了研究，如搅拌釜式③、气升式、固体发酵、固定化细胞发酵等，同时对各种细胞培养的放大问题进行了研究，包括抗生素生产、面包酵母、基因工程菌、动物细胞、植物细胞等。部分报道的细胞培养的规模如表1所示。某些细胞的实际培养规模已经超过了文献报道的水平。对于生物过程的放大，研究人员分别从下列不同方面进行了研究。1.1　影响生物过程放大的几个重要因素1　发酵罐几何相似准则的放大生物过程的放大直接涉及发酵罐本身的放大，因此许多工程人员借鉴化学工程的因次分析法、时间常数法等，并结合相似原理，提出了单位体积功率（P/V）、混合时间（tm）等参数值相似的放大准则。例如Rocha-Valadez等③利用单位体积功率消耗相等的放大准则，将6-戊基-a-吡喃酮（6-PP）发酵从摇瓶放大到10L发酵罐，当P/V小于0.6kW/m3时，6-PP产量随P/V增大而增加；而当P/V大于0.6kW/m3时，由于较大的剪切力，6-PP产量出现下降，并且发现最大6-PP产量和P/V有关而和培养规模无关。这些放大准则单独使用的时候，在某些情作者简介储炬，华东理工大学生物工程学院教授，国家生化工程技术研究中心（上海）副主任。主要研究方向：微生物发酵过程优化与放大。E-mail:[e-mail]：021-64253021表1　部分报道的细胞培养的规模④⑤细胞系BHK细胞（幼仓鼠肾细胞）Verocells（非洲绿猴肾异倍体细胞）鼠杂交瘤细胞黑色素瘤细胞NamalwacellsCHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）BHK-21Tobaccocells（烟草细胞）Taxussp.（紫杉）Yeast（酵母）Penicillium（青霉属）规模/L500100020007000800010000100002000075000100000100000①参考文献Weuster-BotzD,HekmatD,PuskeilerR,Franco-LaraE.Enablingtechnologies:Fermentationanddownstreamprocessing.AdvBiochemEngin/Biotechnol.2007,105:205-247.②参考文献JensenAL,SchultzJS,ShuP.Scale-upofantibioticfermentationsbycontrolofoxygenutilization,BiotechnolBioeng.1966,8:525.③参考文献Rocha-ValadezJA,EstradaM,GalindoE,Serrano-CarreonL.Fromshakeflaskstostirredfermentors:Scale-upofanextractivefermentationprocessfor6-pentyl-alpha-pyroneproductionbyTrichodermaharzianumusingvolumetricpowerinput.ProcessBiochem.2006,41:1347-1352.④参考文献BandaiphetC,PrasertsanP.Effectofaerationandagitationratesandscale-uponoxygentransfercoefficient,kLainexopolysaccharideproductionfromEnterobactercloacaeWD7.CarbohydrPolymers,2006,66:216-228.⑤参考文献PollardDJ,KirschnerTF,HuntGR,TongIT,StieberR,SalmonsPM.Scaleupofaviscousfungalfermentation:Applicationofscale-upcriteriawithregimeanalysisandoperatingboundaryconditions.BiotechnolBioeng.2007,96:307-317.68生物产业技术2009.04(7月).专题报道工业微生物发酵过程放大策略况下会有一定的效果，然而，在发酵罐放大过程中，体积与尺寸的立方成正比，而其他一些参数与尺寸的变化成不同的指数关系，这个指数变化范围可能比0小，可能比3大。表2显示了不同放大准则下从80L放大到10000L时各参数的变化情况。从表2可以看出，要同时满足这些相似条件是不可能的，例如保持单位体积功率不变，则循环时间增加到2.94倍；而要在放大过程中保证循环时间相同，则单位体积功率要增加到25倍，这种对功率的放大要求对于大型发酵罐来说是很难做到的，因此大型发酵罐的混合时间往往要更长。2　供氧能力相似准则的放大对于好氧发酵来说，氧的供应至关重要，它直接影响到细胞的初级代谢、次级代谢和能量代谢，如果要实现较好的过程放大，氧传递速率（oxygentransferrate，OTR）必须知道，因此，体积氧传递系数（KLa）相似的放大准则得到运用。发酵罐培养中的溶氧问题比摇瓶更为突出和复杂，因为它的氧传递过程并不像摇瓶培养中仅限于培养液与空气的表面更新，而是培养液与气泡在更深层次接触过程中的氧传递，与它相关的参数主要有：通气量（Q），混合时间（t），搅拌转速（N），单位体积消耗功率（P/V），发酵液黏度（m）等，其经验关联式可大致表示为：（1-1）Bandaiphetd等⑥研究了通气量和搅拌速率对KLa的影响，并根据KLa相等准则将发酵放大到中试规模；而Pollard等⑦则比较了不同放大准则的效果，表明根据KLa相等的放大准则比根据单位体积功率或混合时间相同的效果更好。同时，在生物过程中，也有人致力于改善供氧条件的放大研究。Hensirisak等⑧研究了微泡分布发生器（microbubbledispersiongenerator）在不同规模发酵罐上对改善传氧的作用，结果表明微泡分布发生器在氧的传递方面比常规喷头表现更好；Junker等⑨则在中试规模上进行了径向流Rushton桨叶和轴向流水翼桨（MaxfloT和A315）对KLa、传质以及P/V的比较。Gill等⑩对小型生物反应器中的氧传递特性进行表2　放大参数的相互依赖性按比例放大准则功率（PO）单位体积功率（PO/V）叶轮转数（N）叶轮直径（Di）Pumprateofimpelle（Q）循环时间（tc）叶轮外缘最大速度（NDi）雷诺数（NDi2r/m）80L发酵罐1111111110000L发酵罐恒定PO/V12510.34542.52.941.78.5恒定N312525151251525恒定NDi250.20.2525515恒定Re0.20.00160.0455250.21注：tc≈tm/4，tm为混合时间。⑥参考文献BandaiphetC,PrasertsanP.Effectofaerationandagitationratesandscale-uponoxygentransfercoefficient,kLainexopolysaccharideproductionfromEnterobactercloacaeWD7.CarbohydrPolymers,2006,66:216-228.⑦参考文献PollardDJ,KirschnerTF,HuntGR,TongIT,StieberR,SalmonsPM.Scaleupofaviscousfungalfermentation:Applicationofscale-upcriteriawithregimeanalysisandoperatingboundaryconditions.BiotechnolBioeng.2007,96:307-317.⑧参考文献HensirisakP,ParasukulsatidP,AgblevorFA,CundiffJS,VelanderWH.Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation.ApplBiochemBiotechnol.2002,101:211-227.⑨参考文献JunkerBH,StanikM,BarnaC,SalmonP,BucklandBC.Influenceofimpellertypeonmasstransferinfermentationvessels.BioprocessEng.1998,19:403-413.⑩参考文献GillNK,AppletonM,BaganzF,LyeGJ.Quantificationofpowerconsumptionandoxygentransfercharacteristicsofastirredminiaturebioreactorforpredictivefermentationscale-up.BiotechnolBioeng.2008,100:1144-1155.参考文献Garcia-OchoaF,GomezE.Bioreactorscale-upandoxygentransferrateinmicrobialprocesses:Anoverview.BiotechnolAdv.2009,27:153-176.KLa=KPgVc1Qc2mgmc369生物产业技术2009.04(7月).了定量分析，用来预测发酵过程的放大。Garcia-Ochoa等对好氧生物过程的放大以及氧传递进行了很好的综述，认为生物反应器中的气－液传递与流体动力学状况有很大的关系，这些状况受到反应器的结构、能量耗散、培养液的物理化学特性以及培养细胞等因素影响。3　菌体代谢在放大过程中，作为生产者的菌体，其对放大效果的影响是通过菌体的生理代谢变化情况而体现出来的，例如反映微生物生理特征的摄氧率（oxygenuptakerate，OUR）和二氧化碳释放速率（carbondioxideevolutionrate，CER）、基质消耗速率、呼吸商（respiratoryquotient，RQ）等宏观代谢流参数。因此，也有人根据这些反映菌体代谢情况的参数进行放大研究。范代娣等研究了以菌体最大摄氧率（OURmax）为基准的发酵放大，从酵母、苏云金杆菌放大来看，摄氧率与菌体产生量有直接关系，摄氧率越大，菌体产量也越大，通过改变罐内工艺条件，使罐内发酵的OURmax与摇瓶发酵OURmax相一致，放大取得了满意的结果。4　培养条件在生物反应器中的细胞是具有生命的活体，其代谢活力受到生长环境