干细胞移植治疗神经变性疾病_百替生物

@100biotech.com干细胞移植治疗神经变性疾病济南军区总医院神经内科金善神经变性疾病为一类缓慢起病、病程呈进行性发展、预后不良的疾病，迄今尚缺乏有效的根治方法。临床常见的神经变性疾病有帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）、肌萎缩侧索硬化（Amyotrophiclateralsclerosis，ALS）、亨廷顿舞蹈病（Huntington’sdisease，HD）和阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）等。这些疾病虽病因各异但在病理上均有中枢神经不同部位及不同程度的神经元脱失和功能异常。替代丢失的神经元，使之功能恢复，是治疗这类疾病的新思路。干细胞是一类未分化的多潜能细胞，近年来的研究发现体外培养的干细胞不仅可以增殖、分化,而且还可以发生“转分化”（transdifferentiation），也即一种组织来源的细胞可以分化为其他不相关的组织细胞类型。例如，造血干细胞（hematopoieticstemcel）、间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCｓ）等在一定的体外条件下可以向成熟神经细胞分化。体内实验也证实神经干细胞或非神经组织来源的干细胞移植入受损的脑组织内可以分化为成熟的神经细胞，新生的神经细胞能替代脱失的细胞发挥功能，为这类神经系统难治性疾病提供了新的治疗方法。一、干细胞移植治疗帕金森病PD患者黑质多巴胺能神经元严重缺失，替代缺失的多巴胺能神经元是干细胞治疗PD的关键。McKay等[1]体外扩增小鼠的胚胎干细胞，从中分离出神经干细胞，在加有bFGF（牛碱性成纤维细胞生长因子）的培养基中扩增，去除分裂素后这些神经干细胞大量分化为多巴胺能神经元。Sasai等[2]发现将小鼠的胚胎干细胞与骨髓来源的间充质细胞共培养可以促进干细胞的分化，培养后出现大量酪氨酸羟化酶（tyroxinehydroxylase，TH）阳性神经元，这些神经元产生多巴胺，移植入小鼠纹状体后可以存活达2周。但就治疗而言，这些体外培养的分化前体状态的多巴胺能神经元移植后存活时间显然太短，并且这些移植后的细胞是否完全具备成熟中脑多巴胺能神经元的功能仍不明。于是也有人尝试将未分化的干细胞直接移植入体内，利用其在体内特定环境下的分化能力达到治疗的目的。Ende等[3]比较了骨髓来源的干细胞与人脐血干细胞在PD小鼠中的作用。他们将32只PD转基因的B6CBACa-AW-J/A-Kcnj6小鼠分组，一组为对@100biotech.com照，另2组分别给予5.6x106同基因骨髓单核细胞和静脉注射100-110x106的人脐血单核细胞治疗，并且不使用免疫抑制剂。当对照组有50%的小鼠死亡时，骨髓细胞移植组有1只死亡，脐血单个核细胞治疗组有2只死亡。治疗后200天时，对照组小鼠仅有1只存活，骨髓单核细胞治疗组有2只存活（p0.05），而脐血单核细胞治疗组却有4只存活（p0.001）。研究显示人脐血单核细胞显著延缓了小鼠出现临床症状的时间，并且延长了小鼠的存活时间，作用较同基因骨髓细胞显著。近年来随着基因工程技术的发展，已有人尝试将转基因技术与干细胞移植相结合治疗PD。Park等[4]将胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的基因转入到雄性鼠的骨髓间充质干细胞，然后将此细胞移植到健康的雌性鼠体内，8周后建立1-甲基-4-苯基1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)PD模型，观察转入GDNF基因后的骨髓间充质干细胞对黑质细胞的保护作用，结果发现TH免疫阳性的黑质神经元明显多于对照组，显示转基因后的间充质干细胞对黑质神经元有保护作用。二、干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化ALS病变侵犯脊髓侧索和皮质的运动神经元，导致进行性的运动功能丧失。ALS的病因不明，少数病例有家族史，与100个已知的铜/锌可溶性超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD1）基因突变有关。基因突变导致蛋白质异常折叠，对某些易感神经元（如脊髓的胆碱能运动神经元）产生毒性。目前针对ALS的治疗包括神经营养因子及促进异常蛋白清除的因子等，但这些治疗在动物实验中都未能奏效。而干细胞移植能替代病变部位的胆碱能运动神经元，或者使胆碱能运动神经元再生，为ALS的治疗提供了可能性。从胚胎神经干细胞分化为胆碱能运动神经元已获成功[5]。核转录因子活化某些基因序列是使干细胞转化为运动神经元的关键，其中转录因子Hb9对最终分化为胆碱能运动神经元至关重要。在大鼠，Hb9的表达可以使原始的、nestin反应阳性的胚胎神经干细胞发育成胆碱能神经元[6]，这些细胞有望替代缺失的运动神经元，并通过脊髓前角与相应的肌肉建立再联系。Garbuzova-Davis等[7]将人脐血单核细胞经静脉移植入ALS模型G93A小鼠体内，结果发现移植后至少使小鼠的病程延缓了2～3周。移植细胞进入脑和脊髓内运动神经元变性的区域，并且存活达10～12周。这些细胞迁移至脑和脊髓实质，表达神经干细胞、神经元和神经胶质细胞的标志蛋白nestin、TuJ1（Ⅲ-βtubulin）和GFAP。至于脐血细胞移植后的作用机制，可能不单纯是移植细胞对损伤神经@100biotech.com细胞的替代作用，因为表达神经细胞抗原的细胞数量很少，而更可能的机制是通过对自身免疫过程的调节而产生的神经保护作用。Ende等[8]观察了大剂量的脐血单核细胞对SOD1基因突变小鼠（一种ALS小鼠模型）的作用。该小鼠在4～5个月时出现瘫痪，平均存活期为130天。在所观察的23只小鼠中，2只在出现瘫痪前死亡。剩余小鼠分别于静脉给予5×106的同基因骨髓单核细胞和34.2-35.6×106的脐血单核细胞。结果对照组存活127天，接受骨髓单核治疗组存活138天，脐血单核细胞治疗组存活148天。作者其后的研究表明，当脐血细胞数量增加到70.2～73.3x106后SOD1小鼠的存活期延长到187天，最长者存活210天，而对照组平均存活123.5天，并且均在130天以内死亡。以上充分证明加大移植脐血干细胞的数量可以显著延长SOD1小鼠的生存期。在动物实验的基础上，干细胞移植已在临床上试用于治疗ALS。意大利Mazzini等[9]采集了7例ALS患者的自体骨髓间充质干细胞，在患者自体脑脊液中进行体外扩增，然后采用微量注射泵，经胸7～9脊髓节段局部注射。术后所有患者副反应轻微，如可逆的肋间痛，及腿部感觉障碍；脊髓神经影像学检查正常；患者心理及生活质量未受影响，表明体外扩增的自体间充质干细胞移植治疗ALS安全并有良好的耐受性。尽管临床有效性并不是本实验的主要研究目的，但实验却发现有4例患者移植3个月后部分肢体的肌力减退延缓，2例肌力并有轻度增加。三、干细胞移植治疗亨廷顿舞蹈病HD是由于基因突变导致纹状体内GABA能神经元死亡所致。HD是最适合采用干细胞移植治疗的神经系统疾病之一，因为目前对HD病变神经元的类型已较为明确，并且HD迄今尚缺乏其他有效的治疗手段。JaeK[10]等将体外培养的人神经干细胞移植入大鼠的纹状体中，一周后以3-硝基丙酸诱导HD，发现与未注射神经干细胞的HD大鼠比较运动功能有明显改善，并且纹状体内神经元的损伤也显著减轻。免疫组化及原位杂交检测发现移植的干细胞表达BDNF，从而提示BDNF的分泌可能是细胞移植改善HD大鼠神经功能的原因之一。B6CBA-TgN(Hdexon1)62Gpb小鼠是一种转基因HD小鼠，有实验发现该小鼠分别接受了71-74x106和100-105x106的人脐血单个核细胞治疗后，其生存期从平均88天分别延长到97.8天和103.4天，并且治疗组小鼠体重下降的程度明显减轻[11]。体外培养的干细胞向纹状体GABA能神经元的分化需要转录因子如Dlx-1，Dlx-2，Pax6和Gsh2的作用。对这些转录因子的进一步研究将@100biotech.com有助于促使干细胞成功地向GABA能神经元分化，使GABA能神经元移植治疗HD成为可能。四、干细胞移植治疗阿尔茨海默病AD的病因和发病机制复杂，其主要的病理变化是Meynert基底前核胆碱能神经元的变性和脱失,以及随后发生的大脑皮质和海马胆碱能神经纤维的减少,使以乙酰胆碱为递质的神经元之间的联系受阻,从而导致痴呆。利用干细胞向神经细胞的分化潜能，替代变性或丢失的胆碱能神经元成为近年AD治疗的研究热点。国内有人[12]采用神经干细胞及人脑源性神经生长因子（hBDNF）基因修饰后的神经干细胞，经侧脑室移植给一侧穹窿海马伞切断的AD大鼠，移植后2周经Moriss水迷宫测定，表明大鼠记忆功能较对照组改善，尤以hBDNF基因修饰后的神经干细胞移植大鼠为甚。WANG等[13]观察了体外培养的胆碱能神经干细胞对AD小鼠的作用。作者应用鹅膏蕈氨酸损伤右侧Meynert基底核制备AD模型。4周后经前额叶皮质移植体外培养的胆碱能神经干细胞。于移植后8周经8臂迷宫实验检测小鼠学习记忆功能。结果发现移植后的AD小鼠学习记忆功能较未治疗组明显改善而与正常对照组无显著差异。12周后脑组织免疫组化检测发现，移植后的胆碱能神经干细胞在额前和顶叶皮质处存活，并分化为胆碱能神经元；移植区周围胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性细胞增多，阳性细胞迁移并整合至皮质；在注射部位周围β淀粉样蛋白（A-β）表达减少。组织学发现移植细胞具有正常细胞的细胞核和细胞体。Ende等[14]曾采用大剂量的人脐血单核细胞移植给转基因ALS小鼠和HD小鼠，明显延长了动物的存活时间。在此研究的基础上，他们又将大剂量的人脐血单核细胞经静脉移植给AD转基因小鼠，结果同样也显示AD小鼠的存活期较对照组明显延长。以上结果似乎为临床应用干细胞治疗AD提供了令人乐观的前景。然而，由于AD致病机制的复杂性，对移植的结果仍需持审慎态度。例如，β淀粉样前体蛋白（APP）的异常代谢可能会影响到移植干细胞的生物学特性。APP的过量沉积会导致干细胞向神经胶质细胞转化，尽管神经胶质细胞的激活对清除A-β是有益的，但干细胞向神经元转化以替代变性或脱失的神经元才是移植的主要目标。因而，尚需进一步阐明AD病理变化对干细胞生物特性的影响，为干细胞的应用提供更多的指导。五、干细胞移植中存在的问题尽管近年来应用干细胞移植治疗多种神经变性病的实验研究已取得了令人瞩目的进展，并已初步@100biotech.com试用于临床，然而，要真正将这些技术在临床推广应用，仍有许多问题需要解决。1、移植干细胞的种类目前研究较多的主要为自体干细胞移植及同种异体干细胞移植。用于神经系统疾病治疗的自体干细胞主要有骨髓干细胞及外周血干细胞；异体干细胞主要有胚胎干细胞、异体骨髓干细胞及脐血干细胞。自体干细胞的优势在于不存在移植排斥反应，但是因为来源于患者自身，疾病所致的内环境的改变有可能使干细胞的增殖分化能力受限。异体干细胞中胚胎干细胞为全能干细胞，具有高度的分化能力，可以建系传代，增殖能力强，理论上有广泛的应用前景。但胚胎干细胞的使用存在着复杂的伦理道德及法律上的限制，同时目前尚不能控制胚胎干细胞在特定部位的分化，容易导致畸胎瘤的发生。异体骨髓干细胞和人脐血干细胞两者细胞成分相似，包含有造血干细胞、间充质干细胞及内皮祖细胞等。近年来的研究显示，造血干细胞及间充质干细胞具有向神经细胞转分化的能力。有人发现体外培养的人骨髓来源的造血干细胞表达神经起源的转录因子及神经元和少突胶质细胞基因[15]，人脐血来源的造血干细胞在体外可以“转分化”为神经元样细胞和神经胶质细胞[16]。间充质干细胞的体外及体内实验也显示其在某些诱导因子的作用下或体内内环境改变时具备向神经细胞转分化的能力[14][15]。上述这些研究结果为造血干细胞和间充质干细胞在神经变性疾病中的应用提供了理论基础。骨髓干细胞的特点在于易采集、操作简单，如取自自体则不存在免疫排斥反应，较适合用于临床应