FABP-5基因沉默对宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响

中国组织工程研究第20卷第15期2016–04–08出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchApril8,2016Vol.20,No.15P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·陈逢振，女，1985年生，天津市人，汉族，2010年山西医科大学毕业，硕士，医师，主要从事妇科研究。通讯作者：尹利荣，教授，主任医师，天津医科大学第二医院妇科，天津市120000中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)15-02218-07稿件接受：2016-02-26细胞生物学特性的影响陈逢振，尹利荣(天津医科大学第二医院妇科，天津市120000)引用本文：陈逢振，尹利荣.FABP-5基因沉默对宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响[J].中国组织工程研究，2016，20(15):2218-2224.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.013ORCID:0000-0002-5772-964X(陈逢振)文章快速阅读：文题释义：基因沉寂：也可以被称为基因沉默，是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。以前，基因沉寂被理解为是真核生物染色体形成异染色质的过程。最近的研究表明，基因沉寂与异染色质存在差异，尽管被沉寂的基因区段也呈高浓缩状态，但基因沉寂所形成的染色体构象并不完全等同于异染色质构象。除此之外，两者还存在着基因表达调控程度上的差异，一般认为处于基因沉寂的染色质区的基因表达被彻底关闭，而异染色质状态的基因可能依然进行低水平的表达。FABP-5基因：FABP-5是一类同源性极高的小分子胞内蛋白，属于脂结合蛋白超家族成员，由126-134个氨基酸组成，对脂肪酸有高度的亲和力，在哺乳动物肝脏中可高表达，广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物的脂肪、脑、肠、心、骨骼肌等细胞中。FABP的配体范围很广，包括长链脂肪酸、溶血磷脂酸、血红素、脂肪酰辅酶A等。FABP与多种肿瘤的发生相关联，其可进入肿瘤细胞核内发挥其可能的调控功能。摘要背景：研究发现肿瘤相关基因以及肿瘤基因通路的改变在肿瘤的形成与发展中起重要作用。目的：探讨siRNA干扰技术沉默FABP-5基因表达对人宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响。方法：以人宫颈癌SiHa细胞为研究对象，根据FABP-5mRNA编码序列设计并合成干扰siRNA序列，瞬时转染SiHa细胞。用RT-PCR和Westernblot法分别从mRNA水平和蛋白水平检测FABP-5基因的表达；流式细胞技术检测各组细胞周期的变化；CCK-8法测定细胞体外增殖能力；细胞侵袭小室法检测各组细胞的体外侵袭力；TUNEL染色检测各组细胞的凋亡情况。结果与结论：与转染空病毒阴性对照组和未转染空白对照组比较，FABP-5siRNA组FABP-5mRNA和蛋白表达明显下降，细胞生长速度明显减慢，细胞周期阻滞在G0/G1期，S期细胞数减少，细胞侵袭力显著下降，细胞凋亡率明显升高。结果说明siRNA技术可以成功诱导FABP-5基因沉默，从而影响宫颈癌SiHa细胞的的生长、增殖和凋亡。关键词：组织构建；组织工程；宫颈癌；FABP-5；siRNA干扰；SiHa细胞；细胞周期；细胞增殖；细胞侵袭；细胞凋亡主题词：RNA,小分子干扰；脂肪酸结合蛋白质类；宫颈肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡沉默FABP-5基因对宫颈癌SiHa细胞的影响siRNA干扰技术沉默FABP-5基因设计并合成干扰siRNA序列转染宫颈癌SiHa细胞细胞增殖受到抑制细胞侵袭能力降低细胞凋亡显著增加陈逢振，等.FABP-5基因沉默对宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH2219:YinLi-rong,Professor,Chiefphysician,DepartmentofGynecology,SecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin120000,ChinaEffectsofFABP-5genesilencingonthebiologicalcharacteristicsofthecervicalcarcinomacelllineSiHaChenFeng-zhen,YinLi-rong(DepartmentofGynecology,SecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin120000,China)AbstractBACKGROUND:Cancerrelatedgenesandpathwaysplayacriticalroleinformationanddevelopmentofcancer.OBJECTIVE:Toinvestigatethesilencingepidermalfattyacidbindingprotein5(FABP-5)bysiRNAinterferenceonbiologicalcharacteristicsofthecervicalcarcinomacelllineSiHa.METHODS:DesignandsynthesisofsiRNAinterferencesequenceusedtotransientlytransfectSiHacellswasperformedaccordingtoFABP-5mRNAcodingsequence.mRNAandproteinexpressionsofFABP-5weredetectedbyRT-PCRandwesternblotassay,respectively.Meanwhile,cellcycle,proliferation,invasionandapoptosisweredetectedbyflowcytometry,cellcountingbit-8assay,Boydenchamberassay,andTUNELstaining,respectively.RESULTSANDCONCLUSION:FABP-5mRNAandproteinexpressions,cellgrowthspeed,cellnumberatSphase(cellcyclewasarrestedattheG0/G1phase)andcellinvasionweresignificantlydecreased,whilethecellapoptosiswassignificantlyincreasedinFABP-5siRNAgroupcomparedwiththenegativecontrolandblankcontrolgroups.OurfindingsindicatethatthespecificsilencingFABP-5geneexpressionbysiRNAinterferencecaninhibitSiHacervicalcellgrowthandproliferation,butacceleratecellapoptosis.Subjectheadings:RNA,SmallInterfering;FattyAcid-BindingProteins;UterineCervicalNeoplasms;CellProliferation;ApoptosisCitethisarticle:ChenFZ,YinLR.EffectsofFABP-5genesilencingonthebiologicalcharacteristicsofthecervicalcarcinomacelllineSiHa.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(15):2218-2224.0引言Introduction目前关于宫颈癌的现有治疗手段均不理想[1-3]，有必要寻求一种新的治疗方法，以提高宫颈癌的治愈率，改善宫颈癌的预后。研究发现癌基因与抑癌基因会在肿瘤的发展过程中扮演重要角色，利用抑癌基因控制肿瘤的生长为防治肿瘤制定了新的策略，也是目前研究的热点问题[4-6]。表皮型脂肪酸结合蛋白5(fattyacidbindingprotein-5，FABP-5)基因存在于多种细胞中的脂肪酸结合蛋白，在多种肿瘤中FABP-5基因可呈高表达[7-9]。siRNA技术是近年来新发展的一项基因沉默技术，siRNA不仅具有更高的基因特异性，而且抑制基因的表达效率比核酶或反义核酸高很多[10-12]。RNA干扰作为一种抑制癌基因表达的手段，早已应用于肿瘤的治疗[13-15]。实验通过siRNA技术沉默FABP-5基因后导入人宫颈癌SiHa细胞中，探讨其对人宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞学体外观察实验。1.2时间及地点实验于2014年1月至2015年7月在天津医科大学动物实验中心完成。1.3材料人宫颈癌细胞系(SiHa)购自上海拜力生物科技有限公司；siRNA靶点设计、同时带有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)和嘌呤霉素抗性筛选标记的3种FABP-5基因沉默重组慢病毒颗粒LV-shRNA-FABP-5(1，2，3)及对照空载体慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)均由上海吉凯基因技术有限公司提供；TRIzol购自Invitrogen公司；DMEM、PBS、胎牛血清均购自Hyclone公司；反转录试剂盒购自美国Fermentas公司；荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程(大连)有限公司；Westernblot及IP细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF)、20×TBS缓冲液、BCA蛋白浓度测试试剂盒(增强型)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)等均购于杭州碧云天生物科技公司；DNAMarker购自广州东盛生物科技有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；流式细胞仪购自德国Merck公司；碘化丙啶和RNase酶购自美国GIBCO公司；细胞侵袭实验采用CellInvasionAssayKit(ChemiconInternationalCat.No.ECM550)；FABP-5和GAPDH基因的引物由上海吉玛制药公司合成并通过测序验证；荧光显微镜购自奥林帕斯公司；凋亡试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人FABP-5单克隆抗体购自美国BeckmanCoulter公司；鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自北京博奥森公司。陈逢振，等.FABP-5基因沉默对宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响P.O.Box10002,Shenyang110180小牛血清、100U/mL左氧氟沙星的DMEM培养基中，于37℃，体积分数为5%CO2密闭式孵箱内培养、传代。随机选取处于对数生长期的宫颈癌SiHa细胞分为3组：FABP-5-siRNA组加入Lv-siRNA-FABP-5，阴性对照组加入LV-siRNA-NC，空白对照组常规培养。转染前12h应用胰酶消化对数生长期的人宫颈癌细胞株SiHa细胞，所制得的细胞悬液接种于6孔板(细胞数约为5×104)，于37℃、体积分数为5%CO2培养箱培养待细胞融