ELISA测定技术的发展和质量控制

ELISA测定技术的发展和质量控制ELISA测定技术的发展和质量控制ELISA试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。然而，影响ELISA试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。一、ELISA试剂盒测定技术的发展临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。1、基因工程试剂对免疫测定技术发展的影响免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各总化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。HBsAg试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗，多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位。可测得HBsAg变异样品。提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用ParlEhrich学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05nｇ/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml2、基因工程较早用于免疫测定的基因工程抗原是HBcAg和HBsAg,这两种基因工程抗原的出现，较好地解决了抗HBc和HBe的测定问题。因为要从病毒本身去大量获取这两种纯抗原较为困难，并且这一点对于难培养的病原微生物来说，如HIV、HCV和梅毒螺旋体等都有些共性。2.1HCV-ELISA试剂HCV目前尚不能体外培养，只能用基因工程或化学合成方法获取HCV结构和非结构区的各种抗原片断，已知HCV基因组有7个功能区组成：核心、E1、E2/NS1NS2NS3NS4NS5(有分为NS5a和NS5b)区，合成抗原的优点是易于纯化，特异性好，抗原抗体反应强。2.1.1第一代抗HCV-ELISA试剂盒：-由美国ortho公司克隆C1003抗原几个片断与人超氧化物歧化酶（SOD）结合。用酵母从病毒基因组非结合区得到表达，表达为融合蛋白，亦作为包被固相载体。-抗原组合：NS4区二个基因片断为NS5-1-1和C1003-特性：IgG抗C100在发病后数月后，才检出，故不宜作早期诊断。-约由20%的病人不出现抗体。IgM抗-C100急性期检出率只有64%。-C100的抗原性较弱，在HCV复制中，不能充分暴露宿主的免疫系统。-特异性和灵敏性较差。2.1.2第二代HCV-ELISA试剂盒-用基因重组的HCV结构蛋白与非结构蛋白抗原包被固相载体。-抗原组合：核心区（C区）多肽C22NS区多肽C33C1003和NS5-1-1-增加C22区和C33区后，抗体出现早，有助早期诊断，提高阳性率。有利早期诊断。-C22是早期易出现病毒血症2.1.3第三代HCV-ELISA试剂盒人工合成多肽抗原，由36个氨基酸组成的Cp9(内壳蛋白)和19个氨基酸组成Cp10混合包被固相载体。抗原组合：除有C100-3C22C33外又增加了core和NS3NS4NS5特点：*coreNS3NS5由Baculovirus重组表达，没有非特异性的载体，试剂特异性高，重组的蛋白经融合形成大分子抗原，利于提高检测灵敏度。*NS3区增加了氨基酸片断（比例十分重要）。改进了反映的灵敏度。*NS5经优化，徐去了非特异性的区域（G-D-D）NS3NS5是血转化最早测得的抗体，提高了诊断的准确性。*NS4为俩个片断的合成多肽，去掉了非特异性反应的区域，加强了试剂的灵敏度和特异性。2.1.4第四代HCV—ELISA试剂盒-美国新近推出一种包括HCV基因组7个功能区所有免疫决定基的单一融合蛋白，称为多决定基融合抗原，采用表面活性剂处理分界病毒表面复合物，释放HCV核心抗原（core）并用ELISA法，灵敏度可达500拷贝/ml，已接近核酸扩增检测水平。-抗原组合：以Core和NS3作为主要检测片断（比例十分重要）加合成多肽NS4-特点：直接测Core抗原不易发生变异抗IgM和IgG检出率可达100%特异性达99.8%灵敏度为100%3、基因工程抗体及其功能试剂80年代后人们开始使用基因工程技术制备抗体，并进而将抗体分子片断与其它蛋白（或另一种抗体分子）融合得到多功能试剂，到目前为止，基因工程抗体在免疫测定上的应用尚处于一个初级阶段。且主要是将抗体与其它蛋白以融合蛋白形式表达而得到多功能试剂，如澳大利亚学者应用基因工程技术制备了抗人红细胞抗体与HIV-1gpN41的融合蛋白。这种重组蛋白，即基因工程双功能试剂，在此基础上，建立了快速，灵敏和特异的自身红细胞凝集试验（AGEN）.3.1HIV-ELISA抗原/抗体试剂1998年,美国首先研制第四代试剂,对检测HIV的同时检测P24(核心)抗原,故称HIV抗原/抗体试剂,国内已有引进.抗原组成:gp160gp36gp170和单克隆抗p24抗体包被.3.1.2P24抗原测定采用夹心法ELISA,即将将纯化的已知抗体包被，当加入带测血清后，若血清中含有P24与包被抗体形成抗原抗体复合物，再加入酶（HRP）标记HIV抗体。在抗原上又结合了酶标记的抗体，加底物显色后在酶标仪上读结果。近来为提高检测血清中P24抗原的敏感性，将血清中免疫复合物（ICD)解离后再进行测定。发展了（ICD)P24抗原测定技术。3.1.3抗HIV-ELISA试剂目前对HIV的检测原料有了较大改进，主要如下：（1）可用于检测血清或血浆中HIVIgM亚特异性抗体和检测HIV-1、2和多种亚型。（2）标记的抗原：a.含HIV-1B亚型gp41和P24的HIV-1重组融合蛋白。b.可特异性检测血清或血浆中HIVM群的抗体，绝大多数HIV-1.0群和HIV-2群的抗体。c.gp36免疫调控区的HIV-2多肽可测定特异性的HIV-2抗体。d.gp41的俩段HIV1.0群多肽，可测特异性HIV1.0群的抗体和HIV1M群的抗体。从以上抗原设计保证HIV的来自不同亚型/或区域的抗原亚型抗体的检测。减少了变异株的漏检。HIV-1.0.2对759份各类临床样品包括401份HIV-1感染不同阶段病人样品，204分HIV-2感染不同阶段病人样品，和154份与HIV无关的其他疾病患者的样品的检测结果。特异性：99.93%灵敏度：100%对欧洲血液中心的8842份常规鲜血者样品用HIV-1.0.2进行评价筛选，并经确认实验获得的结果。3.1.4HIV确认试剂—免疫印记（WB或RIBA）试剂判断标准我国HIV抗体阳性：至少二条膜带（即gp160/gp120）或至少一条膜带和p24(核心)带同时出现美国HIV-1阳性（任何两个中有二条带（P24gp41gp120/gp160）,HIV-2无阳性WHO:HIV-1阳性（不管有无核心带或酶带，但有两条膜带）HIV-2阳性（不管有无核心带或酶带，单有两条膜带即为阳性）4、基因工程酶及其融合蛋白除了基因工程抗原、抗体外，与标记免疫测定有关的另一中重要的基因工程试剂就是酶及其融合蛋白，以重组酶建立免疫测定方法较为成功的是CEDIATM均相酶免疫试验。使用基因工程酶技术生产免疫测定标记酶，是得到符合标记要求的高纯度酶的一条新途径，但如以其他蛋白（抗原或抗体）融合的方法，不但避免了繁琐且低效率的酶与蛋白的化学交联，而且无需得到纯化的酶和抗原或抗体。随着分子生物学技术的发展，将有越来越多的酶免疫测定方法建立在基因工程酶或其融合蛋白的基础之上。发展趋势如下：1）、由单一病原蛋白向多决定簇融合蛋白转变，并尽可能包括病原体基因组功能区的所有的能引起肌体免疫应答的决定簇。2）、表达的抗原将尽可能少含有非特异性抗原或共同抗原。3）、为某一目的如病原体基因型确定而设计表达特定的多肽抗原片断。总之，将围绕改善免疫测定的特异性和敏感性来制备基因工程片断。二、试剂盒的方法学设计目前，ELISA的测定模式，主要有双抗体夹心法测定抗原，如HBsAg,HBeAg,AFP,HCG等；间接法测定抗体如HCV,抗HIV等；双抗体夹心法测抗体如HBs，竞争法测抗体，如HBe,抗HBc等；竞争法测抗原，如激素等小分子。固相捕获法测IgM抗体等，这里只简述双抗夹心法测抗原。目前有一步法和二步法之分。1、HBsAg-ELISA法：?1.1一步法：在加入待测物的同时加入酶结合物一起温育，一步即完成反应过程，一步法ELISA的反应曲线为钟型曲线(见图1)，也就是说测定随着待测物中抗原浓度的增加而升高至一定后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(HOOKeffect)，也就是我们在免疫沉淀实验中所称的“带现象”。一步法的反应平衡式如下：?Ab+Ag+Ab*→Ab·Ag·Ab*+Ab·Ag+Ag·Ab*+Ab*·Ag·Ab*?(a)(b)(c)(d)?其中a为最后测定结果的显色源，当待测物中Ag浓度增加时，无疑会使b,c,和d复合物增加，从而消耗有限的Ab*,使a复合物相应减少，显色降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线成钟型曲线，而且由于d复合物的形成，使得在同样的Ab*浓度下，一步显色较二步法为浅。?目前一步法所出现“钩状效应”，现已有进展，即采用包被为一种抗体，酶标记用空间距离较远的决定簇的抗体，同时在操作中充分混匀反应液，并适当延长温育时间，则可使b,c和d复合物减少到最低程度，而不出现“钩状效应”图1一步法ELISA抗原浓度与显色变化的反映曲线二步法：随着待测物中抗原浓度的逐步增加，将使固相抗体与抗原的结合逐步达到饱和(见1式)，这样在一定浓度Ab*的存在下，Ab·Ag复合物的形成将直接与Ab*结合(见2式)，抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，而形成S形变化曲线(见下图2)：?Ab+Ag→Ab·Ag(1)Ab·Ag+Ab*→Ab·Ag·Ab*(2)综上所述，一步法ELISA试剂盒作为适合临床实验室简便快速要求的产物，有着巨大市场，其虽有潜在缺陷，易导致高浓度待测物的标本检测为假阴性，但精心的实验设计，对包被和酶标记抗体的仔细选择，完全可以将“钩状效应”出现的可能性降至最低。图2二步法ELISA抗原浓度与显色变化的反映曲线灰区概念：合并二种方法一步法试剂其反应平衡点为图中反应曲线A点,处在抗原抗体反应的上坡图中，故受反映条件的改变而影响A值二步法抗原抗体反应已达反应的平台期从图见一步法A点则受反应条件的改变而影响A值。因此出现△Al(可能是假阳性)，△A2(可能是假阴性)。因此将A1—A2间的区域称为灰区。灰区的设置有二种方法：1、以试剂批内CV值（一般为15%左右）设定，灰区范围为CO（1+CV）2、以试剂盒用临界值血清测定S值来设定，公式为CO+2S。以上一般以S值确定的灰区范围比CV值确定值要大。凡灰区范围内的结果可报告可疑或重复检测。2.HIV检测法目前市场上也有一步法和二步法两种。，一步法存在以下三个问题：①钩状效应（HookEffect）：有漏检倾向②HIV-2型抗体的检测：P19、P20两个HIV-2型抗体强阳性标本的检测中，二步法试剂盒OD值至少比一步法试剂高出3~5倍。（3）.本底与一步发试剂盒相比，因二步法试剂盒标本孵育时间长。酶结合物反应充分，特异性强，不仅抗HIV-1、2型阳性标本OD值比一步法高而且本地清晰。一般二步法本地0.02。三、仪器的质量控制随着全自动生化分析仪的不断更新发展，目前国内已有多家引进先进的自动化酶免疫分析仪来替代ELISA法的手工操作，