RNA提取系列

―核酸纯化系统TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTDRNA提取专项RNA相关知识及提取原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护AAAAAARNA相关知识及提取原理－－细胞中RNA的种类和含量AAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105中丰度酵母1050.5-1.5μg拟南芥叶片1mg0.2-0.5μg低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1μg玉米叶片1mgRNA相关知识及提取原理－－RNA的裂解原理异硫氰酸胍/苯酚法细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离胍盐/β-巯基乙醇法盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性β-巯基乙醇变性蛋白RNA相关知识及提取原理－－RNA吸附原理吸附材料纯化原理硅基质高盐低pH值结合核酸低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸高盐低pH值洗脱磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附并携带RNA沉淀法介质吸附RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护RNA提取流程1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得RNA提取流程－－样品前处理注意点选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间去掉培养基，加入一定量TRNzol-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融RNA提取流程－－样品前处理中如何保存样本样品的前处理方式RNA提取流程样本前处理的目的：离散，均一，细胞集或细胞液液氮研磨匀浆或液氮研磨应用红细胞裂解液处理蛋白酶K处理RNA提取流程－－样品前处理Q&AQ-1：样品量是否越多越好？A-1：不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会影响RNA得率；如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相应按比例增加。处理样品量RNA得率实际得率预期得率最大量Q-2：如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解？A-2：研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染；匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保RNA不被降解。RNA提取流程－－样品前处理Q&A1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得RNA提取流程RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒RNA提取流程1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得RNA提取流程－－RNA的纯化及获得RNA纯化要求1纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2排除有机溶剂和金属离子的污染3蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的污染RNA相关知识及提取原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护实验举例使用试剂（以TRNzol－A＋为例）使用试剂盒（以RNApreppure试剂盒为例）操作流程样品前处理、细胞裂解试剂试剂盒纯化沉淀加入吸附柱洗涤溶解RNA沉淀获得RNA产物加缓冲液漂洗RNA洗脱收集细胞基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+)实验举例－－应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA细胞选择贴壁细胞悬浮细胞样品处理量与加入的TRNzol-A+的量要对应1mlTRNzol-A+对应：1血液0.2-1ml2动植物组织30-50mg3贴壁细胞：每10cm2培养面积4悬浮细胞：5-10×106细胞等体积异丙醇沉淀70％乙醇洗涤沉淀晾干溶解RNA吸附柱去蛋白液漂洗洗脱水相RNA传统方法：有机溶剂抽提，得率高柱纯化法：纯度高实验举例－－应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA图片说明：M:TIANGENMarkerIIIA:A公司同类产品提取动物细胞结果T:TIANGEN公司TRNzol-A＋提取动物细胞结果۞试验材料：Helacell/106۞实验方法：TIANGEN公司TRNzol-A+A公司同类产品۞试验结果：得率：TRNzol-A+得率与A公司同类产品略高纯度：经TRNzol-A+纯度较高，无明显DNA、蛋白残留MTA123456实验举例－－应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA实验注意事项－－应用TRNzol－A＋的注意点前处理裂解沉淀洗涤抽提溶解RNA降解处理样品量上清吸取，杂质去除适量异丙醇乙醇，盐离子残留RNA不宜太干操作流程样品前处理、细胞裂解试剂试剂盒纯化沉淀加入吸附柱洗涤溶解RNA沉淀获得RNA产物加缓冲液漂洗RNA洗脱收集实验举例－－应用RNApreppure提取动物组织动物组织研磨或匀浆裂解结合漂洗洗脱植物组织30-50mg动物组织10-20mg悬浮细胞107贴壁细胞10cm2血液0.5-1.5ml胍盐、β-巯基乙醇裂解细胞灭活RNaseRNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合RW1除去蛋白残留RW除去盐离子在漂洗过程中利用DNaseⅠ除去基因组DNARNA在底盐高PH条件下被洗脱用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA裂解结合漂洗洗脱实验举例－－应用RNApreppure提取动物组织胍盐、β-巯基乙醇裂解细胞灭活RNaseRNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合RW1除去蛋白残留RW除去盐离子在漂洗过程中利用DNaseⅠ除去基因组DNARNA在底盐高PH条件下被洗脱用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA裂解结合漂洗洗脱实验举例－－应用RNApreppure提取动物组织胍盐、β-巯基乙醇裂解细胞灭活RNaseRNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合RW1除去蛋白残留RW除去盐离子在漂洗过程中利用DNaseⅠ除去基因组DNARNA在底盐高PH条件下被洗脱用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA裂解结合漂洗洗脱实验举例－－应用RNApreppure提取动物组织胍盐、β-巯基乙醇裂解细胞灭活RNaseRNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合RW1除去蛋白残留RW除去盐离子在漂洗过程中利用DNaseⅠ除去基因组DNARNA在底盐高PH条件下被洗脱用经DEPC处理过的水或专门的缓冲液洗脱或溶解RNA裂解结合漂洗洗脱实验举例－－应用RNApreppure提取动物组织۞试验材料：大鼠肝脏/10mg实验方法：TIANGEN公司RNApreppureKitA公司某柱式RNA提取试剂盒۞试验结果：得率：RNApreppure得率比A公司产品高15％左右高纯度：纯度较高，且无盐份残留121314151617TiangenA公司0.00.51.01.52.02.5TiangenA公司OD260/280OD230/260TIANGENA公司TIANGENA公司MTIANGENA实验举例－－应用RNApreppure提取动物组织裂解结合漂洗洗脱控制提取样品量防止堵柱或漏柱盐离子去除得率控制实验注意事项－－应用RNApreppure的注意点RNA回收率实验注意事项－－洗脱体积与得率关系RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护一些特殊组织的RNA提取纤维组织蛋白/脂肪含量高组织核酸/RNase含量高组织植物组织/真菌组织彻底破碎多次氯仿抽提减少处理量，多次氯仿抽提多次氯仿抽提，特殊试剂RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护RNA的评价与鉴定纯度（OD260/OD280）：紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释10倍左右；溶液裂解法稀释40－50倍）OD260/OD2801.9～2.1说明有DNA污染OD260/OD280＝1.9～2.1说明纯度很好OD260/OD2801.9～2.1说明有部分降解得率紫外分光光度计进行测量；Yield＝OD260×稀释倍数×40ng/ul电泳检测1％琼脂糖，6V/cm，15min，上样1～3ulM12M12DNA残留蛋白残留RNA相关知识及提取方法原理RNA提取流程实验举例及实验中注意点特殊组织RNA的提取RNA的评价与鉴定RNA的保护RNA的保护－－RNA的不稳定性内因：核糖残基的2’和3’位置带有羟基，易被水解外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活RNA的保护－－常用的RNA酶抑制剂焦碳酸二乙酯（DEPC）异硫氰酸胍RNasin氧钒核糖核苷复合物SDS、尿素、硅藻土等RNA的保护－－提取前的保护材料样品中的RNA保护RNA提取工作区RNase的清除实验耗材，器皿的RNase清除塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时，再灭菌玻璃器皿可在180℃烘烤4小时塑料制品和枪头避免交叉污染RNA的保护－－提取过程中的RNA保护组织破碎细胞裂解实验人员适当的破碎方法适量的裂解液正确的操作和防护措施RNA的保护－－保存过程中及后续实验中的RNA保护•保存过程RNAsafe•后续实验RNasinTIANGEN让您的RNA实验更顺利！TIANGEN公司RNA提取试剂/盒硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法DP419RNAsimple总RNA提取试剂盒DP315TIANamp病毒DNA/RNA提取试剂盒DP405TRNzol总RNA提取试剂DP421TRNzol-A＋总RNA提取试剂DP407RNAplant植物总RNA提取试剂RNApreppure系列试剂盒DP430RNApreppure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒DP431RNApreppure动物组织总RNA提取试剂盒DP432RNApreppure植物总RNA提取试剂盒DP433RNApreppure血液总RNA提取试剂盒DP420RNApreppure微量总RNA提取试剂盒TRNzol－A＋总RNA提取试剂RNApreppure总RNA提取试剂盒1样品预处理方式相同2裂解原理不同3RNA纯化原理不同：TRNzol－A＋：有机溶剂抽提，异丙醇沉淀RNApreppure：硅基质吸附膜分离纯化分析比较方法提取材料毒性操作时间RNA质量TRNzol－A＋系列血液、细胞、动物组织＋＋1.5h＋RNAsimple血液、细胞、动物组织＋＋1.5h＋＋RNApreppure系列血液、细胞、动物组织＋20-30min＋＋RNA提取方法比较材料处理量RNA得率人白细胞7×107cells15-20ug成纤维细胞1×106cells5-7ug上皮细胞1×106cells8-15ug材料处理量总RNA产量OD260/OD280人类全血250ul2.6–4.0ug1.9-2.1RNA提取得率比较大鼠组织样品量总RNA量（µg）OD260/OD280脑10mg~81.9-2.1心脏10mg~101.9-2.1肾脏10mg~351.9-2.1肝脏10mg~401.9-2.1脾脏10mg~351.9-2.1肺10mg~101.9-2.1TIANGEN公司RNA相关试剂/盒RNA样本保存试剂RNA保护试剂