HIV不同病程分子生物学检测

HIV不同病程分子生物学检测及结果解读1310115117刘航齐一、HIV核酸检测HIV核酸检测有定性和定量两类,前者用于HIV感染的辅助诊断,后者常用于监测HIV感染者病程进展和抗病毒治疗效果。1.PCR检测法(多聚酶链反应)PCR就是利用DNA聚合酶复制DNA的特性,把生物体内的半保留增殖DNA的过程在体外实验条件下完成。传统的PCR技术比较简便、快捷,但是容易导致“污染”,出现假阳性结果.另外,HIV基因多样性,没有一套引物可覆盖所有HIV序列,使检测敏感性受到限制。从而限制了PCR临床诊断HIV。不同病株存在遗传变异性，进行PCR扩增时应选择病毒基因组中的高度保守序列区设计引物。当核酸检测阳性，应重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判断为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。HIV核酸检测阴性，只报告本次试验结果阴性。2.刷状DNA检测法刷状DNA检测法是定量检测血浆中HIV-1型RNA的一种方法。该技术基于分支DNA信号扩大系统,是人工合成的带有侧链DNA片段,在每条链上都可以标记可被激活的标记物。通过发光强度来定量,发光强度与HIV-RNA含量呈比例。3.核酸序列扩增系统核酸序列扩增系统又称自主序列复制系列或再生长序列复制技术,是以RT-PCR为基础,但它无需将逆转录和PCR扩增分作两部进行，将靶核酸RT-DNA扩增和信号放大扩增。4.基因芯片技术基因芯片技术是20世纪90年代末发展起来的新技术,是在厘米见方的固相载体上,将基因以微点阵的形式排列,应用核酸杂交的原理来检测未知基因,具有操作简单、自动化程度高、检测靶分子种类多、成本低、结果客观性强等特点基因表达、肿瘤诊断、遗传病诊断、基因分型等诸多领域得到广泛应用。对于抗HIV逆转录酶和蛋白酶药物的耐药性分析、型检测结果较好,但对非B亚型的耐药性检测存在漏检和错检。二、HIIV抗体的确证目前我国HIV抗体确证实验采用的方法是免疫印迹法，也就是westenblotting实验，简称WB。WB实验结果有3种，阴性，阳性，和不确定。对于不确定结果每3个月随访1次，共2次，仍属可疑，则报告阴性；如随访期间HIV抗体出现阳性反应则报告阳性。虽然抗体确证不属于分子生物学检验，但由于它在临床中经常应用，因此列举出来。下面是HIV抗体筛查流程。三、分型在HIV-1型内，根据env基因和gag基因序列的同源性差异可分为三个组：M组、O组和N组。M组内又分为A~K11个亚型，各亚型的基因离散率是25％~35％、同一亚型内的基因离散率是7％~20％。不同亚型可发生重组形成很多流行重组型。目前HIV分型的方法主要集中在env、gag和pol区的某一段基因片段的分析。常用的方法有：SBT法、异源双链核酸涌动实验(HMA)、DNA酶联免疫技术、基因芯片法、多重PCR法。1.HMA：在HIV分型检测中，利用PCR扩增evn或者gag一段核酸序列，同时将各亚型的标准质粒进行扩增，将病毒扩增产物和质粒扩增产物进行混合，经过变性和复性形成异源双链产物，然后进行电泳，根据涌动速度确定亚型。2.DEIA：该方法是将特异性DNA探针固定在酶标板上，用病毒基因的扩增产物与探针进行杂交，产物与探针形成杂交链，结合抗DNA双链单克隆抗体后通过酶标二抗进行显色，从而确定待测样品的亚型。3.多重PCR：利用多重PCR进行HIV亚型分析可以直接区别多种亚型。近年来，已针对gag、gp41基因区的亚型特异性引物用于多重PCR进行HIV基因分型，尤其是针对不同流行区的优势流行株设计具有针对性的多种PCR引物，直接通过电泳进行亚种鉴别，不失为一种简便易行的方法。四、病毒载量的分子生物学检测病毒载量测定是对感染者或病人体内游离病毒核酸RNA含量的定量测定。通常使用血浆作为检测样品,根据不同要求改进的RNA提取技术使该试验也可使用多种体液和组织。目前使用的病毒载量测定技术主要有3种:RT-PCR、分支DNA信号扩大系统和核酸序列扩增系统。三种技术均由核酸提取、扩增或信号放大、定量检测四部分组成。五、基因型耐药性的分子生物学检测目前，HIV-1耐药性基因型检测主要是鉴定病毒基因组的特定区域是否存在与特定抗反转录病毒药物的易感性降低相关的特定突变。耐药性基因型检测方法种类很多，各类方法主要集中在耐药性突变位点的检测能力和耐药性突变位点的评价能力上。耐药性突变位点检测即指得到序列信息，目前采用的方法主要是序列测定和杂交法等。1.序列测定法序列测定法是直接检测HIV基因中与耐药性相关联的基因突变，方法是从HIV感染者血浆中提取病毒RNA，采用PT-PCR方法扩增和耐药性密切相关的基因片段进行序列测定后，使用相关工具软件，根据已建立的耐药性突变位点数据库进行耐药位点分析。2.POLA分析法美国凯斯西储大学传染病系ARTS实验室研发了一种针对HIV-1pol基因片段的寡核苷酸链接分析法。该技术原理基于DNA连接酶的酶活性结构域对所覆盖的4个碱基识别的高度敏感性以及结构域对所覆盖的4个碱基识别的高度敏感性记忆液相芯片检测的高通量，能同时对20中最常见的耐药突变进行检测。图1中,A:野生型和突变型模板各50%混合,进行连接识别反应;B:退火过程中,突变BCO的3’端和野生型模板之间发生一个错配(左)而与含突变位点的模板完全互补(右);C:只有与突变模板完全互补的突变BCO与RCO,才能被DNA连接酶连接,而与突变模板有一个错配的野生型BCO与RCO不能被连接酶作用;D:连接酶识别反应的产物与负载了抗标签序列的微球共育。固定在微球上的RCOs的生物素结合链霉亲和素-R-藻红蛋白报告分子。通过检测报告分子的荧光强度确定样品中突变模板的比例。该方法针对每个待检突变位点设计2种探针:上游的微球捕获探针（BCO）和下游的报告分子捕获探针（RCO）。BCO的5’末端是24个寡糖核苷酸的标签序列，能与特定微球上的抗体标签序列互补结合,3’末端与待检位点上游模板互补结合。针对每个位点设计一对BCO,一个与突变密码子(如TAC编码逆转录酶215位点处AZT(抗病毒药物齐多夫定)抗性的Tvr)配对,另一个与野生型密码子(如AAC编码逆转录酶215位点处的Tyr)配对;每一对BCO的标签序列不同,可结合不同荧光微球。RCO与待检位点下游模板互补,其37端标记了生物素,与链霉亲和素一R.藻红蛋白(SA-PE)结合后,可通过液相芯片工作站进行定量检测。研发人员又特别设计了用丁补偿耐药突变之外的模板多态性的竞争寡核苷酸(CMO)和用于去除降低敏感性的非特异性二级结构的寡核苷酸(DNO)。加入反应体系后,进一步提高了检测的敏感陛,对其中17个突变的检测其敏感性低于0.1%,能全面揭示患者体内优势及劣势耐药突变情况。六、HIV的分子生物学治疗目前艾滋病的防治研究主要是针对HIV-1进行的。自从20世纪90年代后高效抗反转录病毒治疗(HAART)应用于艾滋病的临床,使HIV-1患者的病毒载量下降及CD4+T细胞水平升高,降低了HIV的发病率和病死率,显著地改变了HIV-1感染者发展到AIDS的进程。1.反义RNA反义RNA(antisenseRNA)是指与mRNA或DNA互补的小单链RNA分子,通过碱基配对形成mRNA/RNA或DNA/RNA的杂交双链,从而抑制基因表达并加速其降解。天然的反义RNA广泛存在于各类生物中,是细胞基因表达调控的一种方式。近几年来很多研究通过人工合成的反义RNA靶向HIV-1蛋白及靶细胞受体等的基因,与靶基因配对形成无功能的双链从而封闭或调节靶基因功能及产物表达,有效地阻断HIV在细胞中的复制。2.RNA干扰RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指小双链RNA在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA降解,抑制相应基因的表达,从而引起转录后基因沉默的现象。目前研究的有微小RNA(microRNA,miRNA)、小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)、短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)均能够介导RNA干扰作用。miRNA是一类广泛存在于真核生物中的单链非编码小分子RNA,通过与细胞内靶mR-NA3’端-UTR区不完全互补配对或与靶mRNA完全互补配对来发挥抑制mRNA翻译或降解靶mRNA的作用。参考文献：[1]邢玉兰.艾滋病病原学诊断进展[J].中华检验医学杂志,2001,24(3)[2]刘红英.实验诊断HIV方法的应用与进展[J].职业与健康,2005,21(12)[3]韩卫宁,高勇.HIV耐药性及检测方法最新进展[J].国际生物医学工程杂志,2012,35(4)[4]田雅茹,焦艳梅,张彤等.抗HIV-1基因治疗新进展[J].首都医科大学学报,2014,35(1)