HPLC仪的保养及维护.

1江苏联化科技有限公司质量控制部2007-12-09高效液相色谱仪(HPLC)的保养及维护2HPLC的环境设置：HPLC的日常操作条件：温度：10～30℃；相对湿度80％；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。3HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：1专门的纯水机或超纯水机；2去离子水重蒸；3二次或三次重蒸水；4采用类似家用的纯水机；5市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；6其它途径；4不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。5HPLC六通阀进样器的使用及保养六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。6工作原理手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。7虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。8手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。9六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75％，如20μl的定量环最多进样15μl的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。10可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10μl的定量环，实际是9μl还是1lμl并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。11进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0．45μm的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。12等待进样示意图13进样示意图14泵的保养：使用流动相尽量要清洁；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；15柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；进样样品要提纯；严格控制进样量；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；柱的保养：16紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。样品池要保养17液相色谱日常维护18维护流程图吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器检测器19管线选择材料不锈钢TeflonPEEK(聚醚酮)尺寸0.1mmI.D.x1.6mmO.D.0.3mmI.D.x1.6mmO.D.0.5mmI.D.x1.6mmO.D.0.8mmI.D.x1.6mmO.D.20管线材料不锈钢(可用于所有连接)能承受几千kg/cm2压力酸性或高浓度盐环境中易腐蚀(尤其在pH小于2时)PEEK(可用于所有连接)能承受高达250kg/cm2压力可在整个PH范围(pH1-14)内使用不适用于高溶解性溶剂如氯仿等Teflon(用于柱后阻尼管、反应管和排液管)化学惰性大能承受5kgf/cm2压力21吸滤头材料：不锈钢烧结，孔径10um故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成措施：用异丙醇（或5％稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗22单向阀T泵：串联式往复泵D泵：并联式往复泵23单向阀单向阀结构球座吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头抛光面宝石球流动相单向阀原理24单向阀清洗故障：宝石球或球座受污导致密封不好表现：系统压力波动大措施：打开排液阀，以异丙醇为流动相输液拆下单向阀，放入异丙醇中（或5%的稀HON3中加热），超声波清洗25故障1：宝石球粘附于垫片表现：泵无法吸液或排液，流路不通措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗单向阀粘结26柱塞密封圈的更换故障：密封圈磨损导致密封不良现象：系统压力波动大或漏液措施：更换密封圈注意点：1）更换前，新密封圈用异丙醇浸泡15min2）拆卸泵头前，柱塞杆复位（P－SET）流动相泵头清洗管路柱塞杆密封圈27线路过滤器故障：堵塞现象：系统压力波动大或压力偏高措施：异丙醇（或5％稀硝酸），超声波清洗判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力5kgf/cm2，则堵塞。排液阀压力传感器线路过滤器流动相28手动进样器操作注意点：1）进样时，进样针应插到底2）不使用时将针头留在进样器内3）进样应使用液相色谱专用平头进样针4）样品溶液pH小于10,常用密封垫的材质适用pH10,否则换特氟隆材质的密封垫pH10-135）清洗应使用专用针口清洗器定子转子针头密封垫弹簧不锈钢套29清洗针口30HPLC的分离类型正相色谱(NP-HPLC)反相色谱(RP-HPLC)反相离子对色谱(RPIC)离子交换色谱(IEC)空间排阻色谱(SEC)手性化合物分离模式(Chiralseparationmode)31正相HPLC色谱柱硅胶型氰基型氨基型糖类分析二醇基型蛋白质分析SilicagelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)ModifiedSi32反相HPLC色谱柱C18(ODS)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typePhenyltypeTMStypeCyanotype-Si-C18H37SiNon-polarproperty33色谱柱:非极性溶剂:极性水/甲醇/乙腈反相色谱34色谱柱柱效降低原因滤片或填料堵塞样品或流动相中杂质吸附机械振动产生空隙填料变性35滤片或填料堵塞使用预柱缓冲液和溶剂使用0.45um滤膜过滤样品溶液使用0.45um滤膜过滤反向连接色谱柱，使用清洗溶剂以小流量送液打开柱头，清洗或更换滤片Back36样品或流动相中杂质吸附杂质会产生拖尾峰使用高溶解性溶剂清洗色谱柱仅1cm深度会被污染色谱柱取出污染填料，装填新的填料37产生峰变形（如拖尾等）的原因柱进口污染柱内存在空隙样品过载溶解样品的溶剂选择不当二次保留效应担体表面存在硅醇基担体表面残留重金属38溶解样品的溶剂选择不当最好不要选择高溶解性的试剂作为溶解样品的溶剂甲醇作为溶剂20uLCaffeine乙醇作为溶剂20uLCaffeine乙醇作为溶剂10uLCaffeine最好注入少量样品39溶解性效应低溶解性溶剂高溶解性溶剂Back40机械振动产生空隙不要撞击色谱柱如色谱柱掉落或柱压急剧变化。8945612370xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx00000000LC-10AD:::::::输液时不要打开排液阀Back41反相色谱分析时添加10-30mM三乙胺(triethylamine)可以抑制碱性化合物色谱峰拖尾添加1%醋酸aceticacid可以抑制酸性化合物拖尾三乙胺(triethylamine)也用于正相色谱中,使硅胶部分去活性,以获得化合物合适的保留时间42紫外检测器参比池样品池光线硅光电池板43检测池清洗故障：样品池受污表现：样品池和参比池能量相差较大检查方法：设定250nm波长，通甲醇或水，查看SMPLEN和REFEN，如两者相差较大，则样品池受污措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中清洗。44更换氘灯•判断氘灯能量：设定220nm波长，检查参比池能量，如能量低于800，需考虑更换氘灯。2020/1/1045液相色谱常见故障诊状可能的原因解决方法(一)保留时间变化1.柱温变化柱恒温2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够用25mmol/L的缓冲液4.柱污染每天冲洗柱5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命采用保护柱46(二)保留时间缩短1.流速增加检查泵,重新设定流速2.样品超载降低样品量3.键合相流失流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温(三)保留时间延长1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失同前(二)34.流动相组成变化同前(二)45.温度降低同前(二)547(四)出现肩峰或分叉1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五)鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相)通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水48(六)基线噪声1.气泡(尖锐峰)流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声)清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声)采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4同前(四)45.同前(四)35.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱49(八)峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品50泵的操作与维护正如人的心脏一样,高效液相色谱仪中的高压恒流泵必须能可靠的运转.但是要做到长时间低维护的可靠运转,就需要对泵有足够的了解,并注意与之有关的事项.1.通常的设计目前作为商品出售的高压恒流泵多为往复式柱