HPLC检测功能食品中羟基柠檬酸主成份和两种非法添加药物

减肥功能食品中羟基柠檬酸和非法添加成分的HPLC检测藤黄果提取物中的有效成分羟基柠檬酸(HCA)能够抑制柠檬酸裂解酶的活性，减少体内脂肪的形成，从而达到减肥、降血脂的目的。HCA是一种天然植物提取产物，无毒副作用，因而被广泛应用于减肥食品中。西安源森生物市场调查发现，有部分非法厂商为了提高疗效，将非法化学药物添加入标有HCA/藤黄果提取的功能食品中，为消费者的健康带来了极大的威胁。最常见的非法添加药物成分是利莫那班和西布曲明：前者能改善脂代谢紊乱，有助降低体重；后者具有明显的抑制食欲作用。与此同时，过量服用带来的肢体痉挛、攻击性、自杀倾向严重，甚至导致心血管疾病等毒副作用不容忽视。本次实验，西安源森生物采用高效液相色谱法（HPLC）检测功能食品中的HCA及非法添加的利莫那班和西布曲明成分：一、西安源森生物HPLC检测HCA及非法添加成分的材料与方法（一）材料与试剂羟基柠檬酸(HCA纯度98.70%)；藤黄果提取物(HCA含量60%)；藤黄果减肥功能食品5种(羟基柠檬酸功能食品1–5)；减肥功能食品4种(市售)；磷酸(分析纯)；甲醇(色谱纯)；西布曲明对照品；甲醇(色谱纯)；利莫那班对照品(纯度98%，TIC)；(Milli-Q超纯水制备系统)。（二）仪器与设备KQ-600B超声波清洗器；Agilent1100高效液相色谱仪；Milli-Q超纯水制备系统；MS2型漩涡振荡器。（三）试验方法1.储备液的配制称取HCA对照品10.0mg→超纯水溶解并稀释→配制成质量浓度为10mg/mL的标准储备溶液→4℃冰箱保存备用。称取利莫那班与西布曲明对照品各0.0200g于两个10mL容量瓶中→甲醇溶解并稀释至刻度→摇匀→得浓度为2mg/mL的对照品储备液→保存在4℃冰箱中。2.标准混合工作溶液的配制量取各对照品储备液各适量，HCA用超纯水逐级稀释成1.0、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001mg/mL的对照品溶液；利莫那班与西布曲明分别用甲醇稀释制成浓度0.01、0.05、0.1、1、2、5、10、20g/mL系列标准混合溶液。3.样品预处理（1）藤黄果提取物样品处理取藤黄果提取物50mg置于50mL容量瓶中→加水40mL→超声波发生器上超声提取20min→冷却至室温→定容至刻度→摇匀→0.22m有机微孔滤膜过滤，供HPLC测定。（2）胶囊内容物预处理取5粒胶囊内容物混匀→精密称取0.10g→置250mL容量瓶→加甲醇200mL→超声波发生器上超声提取20min→冷却至室温→甲醇定容至刻度→摇匀→经0.22m有机微孔滤膜过滤→供HPLC测定。（3）样品胶囊壳预处理任取胶囊5粒→倾出内容物粉末→用棉花擦拭干净胶囊壳→小心地剪成碎片→置50mL容量瓶→加40mL50%甲醇水溶液→超声波发生器上超声提取20min→冷却至室温→加50%甲醇水溶液定容至刻度→摇匀→经0.22m有机微孔滤膜过滤，供HPLC测定。（4）HPLC色谱条件羟基柠檬酸检测:色谱柱:WatersAtlantisT3-(4.6×150mm)；柱温:20度；进样体积:10L；流动相:99%0.1%磷酸水溶液+1%甲醇；流速:0.6mL/min；检测波长:210nm。利莫那班和西布曲明检测:色谱柱:WatersAt-lantisT3(4.6×150mm)；柱温:20度；进样体积:10L；流动相:甲醇；流速:0.6mL/min；检测波长:223nm。二、西安源森生物HPLC检测HCA含量及利莫那班和西布曲明添加含量实验结果与分析（一）西安源森生物HPLC检测羟基柠檬酸(HCA)分析1.色谱柱和流动相的选择由于HCA极性较大，HPLC检测时需要流动相含水比例较高，而且流动相中需加入0.1%磷酸以防止HCA质子化，我们选用适合在低pH范围内和100%水相兼容的WatersAtlantisT3(4.6×150mm)柱。以1mg/mLHCA为研究对象，采用不同比例的0.1%磷酸水溶液–甲醇为流动相进行实验，结果表明以99%0.1%磷酸1%甲醇为流动相时HCA的仪器相应信号较高，而且保留时间为7.3min，适合分析实际样品中的HCA的含量。2.标准曲线及线性关系将标准工作溶液在优化色谱条件下进样，以峰面积(A)对HCA对照品浓度(mg/mL)作标准曲线，得线性回归方程。HCA在0.001~1.0mg/mL范围内线性关系良好，其线性回归方程和相关系数见表1。线性回归方程Y=95476X–106，线性相关系数r=1。3.检出限测定根据检测结果HCA的检出限(LOD)为0.1g/mL-(S/N3)；HCA的定量限(LQD)为0.3g/mL(S/N10)。4.精密度实验在相同色谱条件下，取1.0mg/mLHCA对照品溶液重复进样6次，测定各次HCA的峰面积A，计算RSD为0.09%(n=6)，表明精密度良好。相关数据表25.加标回收率实验以市售藤黄果提取物和HCA功能食品1为样品，分别添加不同量的HCA对照品溶液，按本方法进行试验，用HPLC进行测定。在低、中、高3个添加水平范围内的平均回收率(每个添加量平行测定6次)为90.49%~103.90%，加标回收率结果见表3。HCA在不同基体中HPLC谱图如图2所示(其中实际样品以功能食品1为例)。6.实际样品检测应用本方法分别对市场上5种HCA类减肥功能食品进行分析测定，这些功能食品均标称以藤黄果提取物或者羟基柠檬酸为主要成分，但是经检测发现其中有三种存在功效成分严重不足的现象。具体结果见表4。（二）利莫那班和西布曲明同时检测1.检测条件确定西布曲明在222.7nm有最大吸收，利莫那班在200nm以后没有强吸收峰，在223nm有较大的吸收，所以为了实现对利莫那班和西布曲明的同时分析，我们选择223nm为检测波长。2.样品处理方法的确定超声波能产生机械效应、空化效应及热效应，从而增加溶剂穿透能力，促进药物成分向溶剂相溶解，提高药物溶出速度和溶出的次数，增加物质成分的扩散，加速提取过程，提高回收率，影响超声萃取效率的因素主要是超声时间。我们分别超声辅助提取10、20、30、40min，比较这两种药物的提取效率结果可知：超声20min即可将样品中的利莫那班和西布曲明提取完全，因此确定最佳提取时间为20min。3标准曲线及线性关系将混合标准工作溶液在优化的色谱条件下进样，以峰面积(A)对对照品浓度(g/mL)作标准曲线，得线性回归方程。利莫那班和西布曲明在0.01~20g/mL范围内线性关系良好，其线性回归方程和相关系数见表5。4.检出限测定按照信噪比(S/N)为3作为检出限(LOD)，利莫那班的检出限为1ng/mL，西布曲明的检出限为3ng/mL；按照信噪比(S/N)为10作为定量限(LQD)，利莫那班的定量限为3.3ng/mL，西布曲明的定量限为10.0ng/mL，完全可以满足目前功能食品中非法添加的定量检测。5.精密度实验在相同色谱条件下，用浓度10g/mL的利莫那班和西布曲明的混合标准溶液进样，每次10L，重复进样6次，分别测定各次的峰面积A，RSD分别为1.47%,1.25%(n=6)，表明精密度良好。相关数据见表6。6.稳定性实验在相同色谱条件下，取同一浓度的利莫那班和西布曲明的混合标准溶液，室温放置0、1、2、4、6、8、12、24h后依次测定，分别测定利莫那班和西布曲明的峰面积，外标法定量，计算其浓度，RSD分别为2.62%，2.13%，表明利莫那班和西布曲明溶液在24h内稳定性良好。相关数据见表7。7.加标回收实验以HCA功能食品1和HCA功能食品2为实际样品，各加入一定量的利莫那班和西布曲明对照品，选定的色谱条件下测定，外标法定量，计算加标回收率，结果见表8。西布曲名和利莫那班在不同基体中HPLC图谱(其中实际样品以HCA功能食品1为例)结果如图3所示。8.实际样品分析应用本方法分别对市场上4种减肥功能食品的胶囊内容物和胶囊壳进行了分析测定，结果见表9，其中功能食品2的胶囊内容物中含有西布曲明41.71mg/g。三、西安源森生物HPLC检测HCA含量及利莫那班和西布曲明添加含量实验结论本次实验，西安源森生物利用HPLC进行功能食品中HCA功效成分分析，同时建立了定量检测减肥功能食品中非法添加的利莫那班和西布曲明的方法，有效提高了分析效率和灵敏度，并具有操作简单、快速的优点，10min即可完成HCA功效成分或两种非法添加的分离检测，为该类减肥功能食品的实际检测工作和产品质量控制提供了一种有效的方法。天然产物功能食品往往因为使用安全、毒副作用低而受到消费者青睐，而一些厂家的非法添加使得很多“天然食品”名不副实，为消费者的身体健康造成了极大的伤害。西安源森生物郑重提示：在专业快速的检测应用于实际产品的之外，这一现象也应引起购买者及相关监管部门的重视。