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当前位置:首页 > 医学/心理学 > 药学 > J-08天然生物材料的提取制药第四节核酸类药物的生产
江苏农林职业技术学院讲稿第1页共4页1第八讲授课内容第二章天然生物材料的提取制药第四节核酸类药物的生产授课时数2教学目标掌握核酸药物的分类和药理功能、生产方法、DNA和RNA的生产工艺。教学重点核酸药物的分类和药理功能,DNA和RNA的生产工艺。教学难点核酸药物的生产工艺。教材教具教学内容(含教学步骤、时间分配、教法学法、作业布置等)复习胸腺素和胰岛素的结构、性质和生产工艺。导入新课:核酸大家比较熟悉,主要指DNA、RNA。今天给大家介绍核酸类药物的制备。第四节核酸类药物的生产核酸类药物间的关系基本结构核酸←———核苷酸(碱基、戊糖、磷酸)←—核苷(碱基、戊糖)+磷酸核酸类药物包括:核酸、核苷酸、核苷、碱基及其衍生物一、核酸药物的分类1、具有天然结构的核酸类物质如:DNA、RNA、肌苷、ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、肌苷酸等。获得:微生物发酵或从生物资源中提取生产。药理功能:有助于改善机体的物质代谢和能量代谢平衡,加速受损组织的修复,促使机体恢复正常生理功能。2、天然碱基、核苷、核苷酸的类似物或聚合物如:三氟代胸苷、叠氮胸苷等。获得:由自然结构的核酸类物质通过半合成生产。药理功能:治疗病毒、肿瘤、爱滋病的重要药物,也是产生干扰素、免疫抑制剂的临床药物。二、核酸类药物的生产方法(一)DNA和RNA的生产方法DNA和RNA是存在于细胞中的正常成分。DNA主要存在于细胞核中,少量(2%)存在于线粒体和叶绿体中;RNA主要存在于细胞质中,少量(10%)存在于核仁、核浆和染色体中。核酸的含量与细胞大小无关,以生长旺盛的组织细胞中含量较多,如动物胰脏、脾脏、胸腺,植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。酵母细胞中RNA含量最多,是提取生产RNA的主要原料。核酸的生产一般采用提取法,即从粉碎、破裂的生物组织细胞中通过一定的方法获取总DNA或总RNA,具体方法后面介绍。这样得到的是多种DNA或RNA的混合物,可以直接用作药物使用,但有时需要较纯的核酸产物,则需进一步的纯化。常用纯化方法如柱层析、凝胶电泳和密度梯度超离心。江苏农林职业技术学院讲稿第2页共4页2获取大分子核酸的另一方法是人工合成,即利用化学的方法按照设定的核苷酸顺序逐一加入形成核酸。现已有核酸合成仪,但合成长度还有一定限制,并且该仪器价格昂贵。因此这种方法一般用于研究,不适合生产。(二)核苷酸、核苷及碱基类似物的生产方法酶解法、半合成法、发酵法1、酶解法生产酵母,从酵母中提取RNA,RNA经青霉菌属或链霉菌属等微生物产生的酶进行酶解,制成各种核苷酸。2、半合成法微生物发酵与化学合成并用。3、直接发酵法采用营养缺陷型菌株或营养缺陷型兼结构类似物抗性菌株来发酵大量生产目的核苷或核苷酸。三、核酸类药物的生产实例(一)DNA的生产技术1、来源DNA主要存在于细胞核中,核DNA占总DNA的98%;另2%的DNA存在于线粒体和叶绿体中。因此,通常选用细胞核含量比例大的生物组织作为提取制备DNA的材料,如胰脏、脾、胸腺等。2、提取原理在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物——核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP),这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大差异。RNA+pro.→RNP(核糖核蛋白)DNA+pro.→DNP(脱氧核糖核蛋白)0→0.14MNaCl溶液DNP溶解度逐渐降低,RNP的溶解度很大;0.14M→0.5MNaCl溶液DNP溶解度逐渐增加。因此,在制备DNA时,可利用0.14MNaCl溶液使DNP与RNP分开。由于DNP在浓盐溶液中的溶解度比稀溶液大得多,所以,首先采用浓盐溶液(1~2M)尽量抽提DNP,然后再去除杂蛋白。3、工艺路线猪脾脏[预处理]组织浆液[预处理]沉淀[抽提]冷冻,绞碎0.1MNaCl-0.5M柠檬酸混合液,离心1.71MNaCl上清液(DNP)沉淀(DNP)溶解液0.14MNaCl10%NaCl氯仿-异戊醇上清液(DNA)沉淀物白色纤维状DNA95%乙醇真空干燥4、工艺过程江苏农林职业技术学院讲稿第3页共4页3(二)RNA的生产1、来源:微生物——酵母通常在细菌中RNA占5~25%,在酵母中占2.7~15%,在霉菌中占0.7~28%,面包酵母含RNA4.1~7.2%。酵母菌体提取优点:(1)收率高,(2)提取容易。2、RNA的提取——等电沉淀法压榨稀NaOH,提取中和,分离pH2.5洗涤、干燥酵母菌体—→菌体—————→提取液———→抽提清液—→RNA——→RNA干粉3、工艺过程(1)预处理:压榨、除水(2)提取:0.13%NaOH,使细胞壁变性,使核酸从细胞内释放出来(3)中和、除菌体(4)分离:等电点法,调pH2.5,使RNA沉淀下来(5)洗涤、干燥(三)ATP制备基本工艺路线:枯草杆菌160(Smr+Try-+Pur-)微生物或化学转化微生物腺嘌呤前体——————————→腺苷——————→AMP————→ATP发酵磷酸化枯草杆菌160(Smr+tyr-+pur-)菌株,在添加腺嘌呤(由丙二氰化学合成)的培养基上培养,可以大量累积腺苷。也可使用发酵法直接生产ATP,所用菌种是产氨短杆菌ATCC6872。(四)辅酶A的生产采用提取法制备,基本工艺流程如下:【绞碎】【水,提取】【TCA,除蛋白】【GAM树脂】新鲜猪肝——→肝浆————→提取液————→滤液————→GAM-CoA煮沸15min4h【HCl-NaCl】【HCl,酸化】【LD-601,再吸附】————→CoA浓集液————→CoA酸化液——————→LD-601-CoA【解吸,脱盐】【浓缩】【酸化】【丙酮沉淀】【脱水干燥】————→解吸液——→浓缩液——→上清液————→沉淀物———→CoA粉(硝酸铵,乙醇)(硝酸)(酸性丙酮)(丙酮,P2O5)三、核酸类药物的检测1、DNA含量测定DNA是磷酸和戊糖通过磷酸二酯键形成的长链,所以磷酸或戊糖的量正比例于DNA的量,可通过测定磷酸或戊糖的量来测定DNA的量,前者称为定磷法,后者称为定糖法。江苏农林职业技术学院讲稿第4页共4页4(1)定磷法磷酸与钼酸反应生成磷钼酸,再转变为钼蓝,吸收峰在660nm。(2)定糖法——二苯胺法670nm2、RNA含量测定(1)定磷法——二苯胺法,595nm(2)定糖法——地衣二酚(苔黑酚)法3、核苷酸、核苷含量的测定紫外分光光度法小结:掌握核酸药物的分类和药理功能、生产方法、DNA和RNA的生产工艺。思考题:1、核酸类药物的种类和药理功能是什么?2、如何检测核酸类药物?课后体会:
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