ISSR分子标记及其在果树遗传学的应用

福建农林大学研究生课程考试卷授课时间2012—2013学年度第一学期学号：___________________研究生姓名：___________________课程名称：__果树遗传学__考试时间：__2012.12.25____考生成绩：___________________授课或主考教师：_________________（签章）ISSR分子标记及其在果树遗传学的应用摘要：ISSR分子标记是在SSR分子标记基础上发展起来的一种DNA多态性检测技术。它是DNA分子标记技术的一种，已在果树遗传育种研究的各个方面得到广泛的应用。ISSR标记符合孟德尔式遗传规律，具有简便、快速、稳定、DNA多态性高等优点。本文主要介绍了ISSR分子标记在果树遗传多样性、种质资源鉴定和亲缘关系分析、遗传连锁图谱的构建等研究的应用。关键词：分子标记；ISSR；果树；遗传20世纪90年代以来，由于PCR技术的出现，基于PCR技术的DNA分子标记，如随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)、简单重复序列(simplesequencerepeat，SSR)或称微卫星(microsatellite)、扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)等受到广泛重视和应用[1]。但RAPD重复性低,AFLP费用昂贵,SSR引物设计费时耗力,使得它们的应用受到一定程度的限制。近几年，人们基于SSR分子标记基础上发展了一种新的分子标记，即锚定简单重复序列（anchoredsimplesequencerepeat，ASSR），也称作简单重复间序列(inter-simplesequencerepeat，ISSR)标记技术或以微卫星为引物的PCR(microsatelliteprimedPCR,MP-PCR)[2]。它是由加拿大蒙特里尔大学的Zietkiewicz等1994年提出的[3]。该技术以加锚SSR寡聚核苷酸作引物，对位于反向排列的SSR之间的DNA序列进行PCR扩增，而不是扩增SSR本身，它在引物设计上比SSR技术简单得多，不需知道DNA序列即可用引物进行扩增，又可以揭示比RFLP、RAPD、SSR更多的多态性，现已在遗传多样性、种植资源鉴定、遗传连锁图谱的构建、基因定位、系统发育等方面被广泛应用，本文主要对ISSR分子标记技术的原理、操作及其在果树遗传、进化等领域的应用作简要介绍。1ISSR分子标记技术的基本原理和特点1.1ISSR分子标记技术的原理在真核生物基因组中均存在着由1～4个核苷酸组成的简单重复序列[4]，如(A)n、(AG)n、(AGC)n、(AATT)n等。植物基因组中最多的SSR是(AT)n、(TA)n、(GA)n、(CT)n等二核苷酸重复序列[5]。ISSR技术的基本原理就是在SSR的3＇或5＇端锚定1～4个嘌呤或嘧啶碱基,然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR间的一段DNA进行PCR扩增,而不是扩增SSR本身。如图1-1。图1-1用重复序列(CA)n作单引物，在引物的5′端或3′锚定1至数个碱基1.2ISSR分子标记技术的特点ISSR分子标记技术是一种在PCR中直接使用微卫星序列进行DNA扩增的分子标记技术。它具有以下特点:(1)实验操作简单、快速、高效，不需要繁琐的构建基因文库、杂交和同位素示踪等操作，DNA用量少,引物设计容易,实验成本低廉。(2)扩增基因组DNA，适应于任何富含SSR重复单元和SSR广泛分布的物种，可同时提供多位点信息和揭示不同微卫星座位个体变异的信息。(3)ISSR分子标记为显性标记,符合孟德尔式遗传规律[6]。(4)遗传多态性好，重复性好。引物较长,通常为16～25bp,而RAPD的引物只有10bp；PCR扩增时的退火温度较高，因此引物具有更强的专一性，与模板结合的强度提高，降低了杂带的干扰，提高了实验结果的可复性。但ISSR分子标记技术也有不足之处，其不足之处在于：PCR扩增反应的最适条件需要一定时间的摸索；ISSR标记大多为显性遗传标记,不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。2ISSR分子标记技术实验操作[7]5′锚定引物NNNN(CA)n3′锚定引物NN(CA)nCACACACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCACACACACACACACACACACACACACA5′锚定引物NNNN(CA)n3′锚定引物NN(CA)n3′锚定引物的PCR产物5′锚定引物的PCR产物ISSR分子技术也主要包括DNA样品的提取、PCR扩增、电泳检测、观察结果及统计分析等步骤。2.1DNA样品的提取提取植物DNA的方法有很多，用于ISSR分子标记的DNA样品的提取方法有：SDS法、CTAB法。虽然不需要用试剂盒对所提取的DNA进行纯化，但仍需对DNA样品进行电泳，检测其质量，并用紫外分光光度计检测DNA与蛋白质的比值。根据需要用无菌水将DNA稀释到所需浓度（10ng／ul），贮存在-2O℃或-70℃冰箱中备用。2.2引物设计引物设计是ISSR技术中最关键、最重要的一步。用于ISSR的引物常为5＇端或3＇端加锚的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列，重复次数一般为4～8次，使引物的总长度达到20bp左右。5＇端或3＇端用于锚定的碱基数目一般为1～4个，锚定的目的是引起特定位点退火，使引物与相匹配SSR的一端结合，而不是中间，从而对基因组中特定片段进行扩增、检测。2.3PCR扩增反应在确定了引物之后，就可以在PCR仪上对基因组中的SSR间序列进行扩增了。扩增步骤主要为变性（denaturation）、退火（anealing）、延伸(extension)，扩增步骤与RAPD技术相似,但不同引物、不同材料的扩增条件有异。以25ulPCR反应体系为例，一般含0.2～0.8μmol/L引物,5～50ng模板DNA和0.4～1.0UTaqDNA聚合酶,PCR反应缓冲液,四种dNTP,需要做预备实验优化PCR条件,以获得清晰、可重复、易统计的条带。2.4PCR产物的电泳与数据分析PCR产物需经电泳分离、染色显示后才能进行条带观察、统计。目前可用于ISSR扩增产物分离的电泳有：浓度为1.5%～2.0%琼脂糖凝胶电泳或浓度为6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，后者的分离效果通常更好。用溴化乙锭(EB)或硝酸银染色后，在紫外光(EB染色)或可见光(银染)下进行观察，统计带纹的有(计为1)或无(计为O)及相对位置，然后即可根据研究目的，应用UPGMA、SPSS等聚类分析软件进行分析。3ISSR分子标记技术在果树遗传学的应用ISSR技术由于引物较长，退火温度较高，这就增强了实验的可重复性，同时实验操作简单、快速、高效，不需要繁锁的构建文库、设计引物、杂交、同位素显示等步骤，而且ISSR标记可以揭示整个基因组的一些特征，并呈孟德尔式遗传，因此该技术一问世就在植物遗传分析中得到了广泛应用。3.1遗传多样性ISSR分子标记技术在果树遗传多样性的应用非常广泛。彭瑜[8]等利用ISSR分子标记方法对20个柚类品种进行遗传多样性研究，揭示了柚类品种间丰富的遗传多样性。张如莲[9]等利用ISSR分子标记技术对香蕉30个品种的遗传多样性进行了分析。通过聚类分析,所得结果与香蕉在形态学上的分类基本符合,只有几个品种的分类有一定的差异,充分显示应用ISSR技术可以有效地进行香蕉品种鉴别,澄清引种过程中出现的同物异名、同名异物现象,以及为香蕉新品种选育的早期选择及杂交亲本的选配提供依据,实现分子标记辅助育种等。余贤美[10]等采用ISSR标记技术对海南、云南、广西3省的12个芒果野生居群共265个个体的遗传多样性水平及居群遗传结构进行研究。广西的3个居群(那坡、邕宁、平南)优先与云南的文山居群聚为一支；而云南的永德和版纳居群各自聚为一支。魏守兴[11]等从74条引物中筛选出23条多态性引物,用ISSR方法对80份海南荔枝种质进行分子标记分析和遗传多样性研究。结果表明,大多数种质的遗传距离在0.12-0.15之间,说明它们的亲缘关系较近。在遗传距离为0.55的水平上,80份荔枝种质被分为7组,海垦8号、琼山3号与永25单独为一组,可能属于海南的地方种质。另外,通过与SSR,RAPD等方法对比,ISSR方法应用前景较好。邹游[12]等利用ISSR技术对采自四川省猕猴桃科研基地的14个猕猴桃品种进行了遗传多样性分析。ISSR标记说明猕猴桃品种间遗传距离与地理分布有一定关系,地理位置较近的品种能聚在一起。3.2种质资源鉴定与亲缘关系果树生命周期长，并长期通过无性方式繁殖，加上不同地域间的相互引种，使同名异物和同物异名现象十分普遍，如何准确地对现有果树品种鉴定和亲缘关系分析，是进一步科学、有效地利用果树资源的基础。借助ISSR分子标记技术，可以在大范围内对果树的遗传物质进行较全面的比较，从而对果树种质资源鉴定和亲缘关系分析。Fang等[13]用ISSR指纹图谱鉴定了柑桔属(Citrus)不同品种，通过22个引物产生的ISSR标记可用于区分68个柑桔品种。吴兴恩等[14]对富民枳、枳、枳橙和甜橙等22份柑桔资源进行了ISSR分析,并对所得结果进行了讨论，发现采用ISSR技术可作为品种鉴别、亲缘关系和分类的手段之一。徐志祥等[15]ISSR分子标记对南丰柑桔品种的遗传多样性进行研究。从100个ISSR引物中筛选出17个多态引物，对14份柑桔样品进行ISSR-PCR分析。UPGMA聚类分析结果表明，以遗传相似系数为0.67为分界线，可以将14份供试柑桔样品分成三类：第一类包含以ss-28为代表的7个柑桔品种；第二类包含以杨小2,6为代表的3个柑桔品种；第三类包括以早系97-1为代表的4个柑桔品种。果树种质资源的鉴定和评价对于育种亲本选择、丰富遗传基础以及种质资源合理利用开发等方面都是非常重要的。以往根据形态学、生理学、农艺性状、同工酶标记进行鉴定分类,但基因型与环境互作使这些鉴定方法受到了许多限制,ISSR分子标记技术具备高效、准确、不受环境及主观因素影响等特点。3.3遗传指纹图谱的构建果树遗传指纹图谱研究技术是在现代仪器分析技术基础上发展起来的,进而对果树进行鉴定和质量控制。研究方法也有多种,分别从不同的角度反映了果树的遗传信息。ISSR标记容易发现多态性，敏感性高，通过ISSR分析可以找出与靶基因连锁的ISSR标记。ISSR标记在杂交群体中呈孟德尔式分离，ISSR遍布基因组，多态性高，因此可用于遗传作图。Sankar等[16]对用ISSR在柑橘作图中效果评价，认为ISSR标记符合孟德尔式分离，标记是显性标记，少部分标记呈共显性分离，可以同RFLP、RAPD、同工酶的遗传图谱相互补充，构建新的遗传图谱，因此ISSR适合柑橘的遗传图谱构建。姜帆[17]等以立冬本龙眼DNA为模板研究了龙眼ISSR-PCR反应体系的主要成分对ISSR扩增结果的影响,并探讨了构建龙眼指纹图谱的可行性,利用丰富的多态性DNA谱带构建了12个基因型龙眼的指纹图谱。刘威生[18]等在优化的反应条件下建立了5个种12份杏材料的ISSR的指纹图谱。雷天刚等[19]利用SSR标记和ISSR标记对102个柑橘栽培品种进行DNA指纹分析，筛选适合的特征引物，构建柑橘栽培品种的指纹图谱数据库。4.结论综上所述，ISSR标记因其引物容易设计，实验重复性强，操作过程简单，不须使用同位素，可以揭示更高程度的DNA多态性，从而在果树遗传研究中具有广阔的应用前景，但任何一种分子标记都不能解决所有问题，在今后的研究工作中，我们应根据自己的研究目的，选择合适的分子标记，或将不同标记结合起来进行综合研究。ISSR标记技术在果树遗传育种中发挥了重要作用。当然ISSR标记亦存在一些缺点,限制了其在某些方面的应用。ISSR标记以其多态性高、可重复性强、简便快速等优势,必将使其在果树种质鉴定、系统发育研究、育种材料早期选择等方面发挥更大的作用。参考文献[1]王建波，ISSR分子标