ITP腹腔镜术前后T淋巴细胞亚群变化与疗效分析

ITP腹腔镜术前后T淋巴细胞亚群变化与疗效分析[摘要]目的：研究分析特发性免疫性血小板减少性紫癜（Immunethrombocytopenicpurpura,ITP）患者腹腔镜前后外周血中血小板相关抗体及T淋巴细胞亚群的变化情况，并探讨其与手术疗效的相关性及临床意义。方法：抽取2013年5月至2014年5月我院ITP行腹腔镜术的患者87例作为研究对象，按照手术前后分别予所有患者以治疗前组与治疗后组命名。另抽取30例健康志愿者作为对照组。检测分析各组的血小板相关抗体及T淋巴细胞亚群的变化情况。结果：治疗前组的PAIgA、PAIgG、PAIgM水平显著高于治疗后组与对照组，治疗前组CD3+、CDD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+、CD16+56+的百分比则均低于治疗后组及对照组，而治疗前组CD3+CD8+、CD19+百分比其余两组。治疗后组与对照组的相关抗体水平、各项淋巴细胞亚群百分比相比，均有P＞0.05，无统计学意义。结论：体液免疫及细胞免疫异常为ITP发病重要因素，腹腔镜前后T淋巴细胞亚群的改变可反映该病的病例过程，T淋巴细胞亚群联合相关抗体检测对了解ITP的发病情况，判断其疗效及预后有重要意义。[关键词]特发性免疫性血小板减少性紫癜；T淋巴细胞亚群；血小板相关抗体；流式细胞术特发性免疫性血小板减少性紫癜（ITP）又名原发性血小板减少紫癜，指无明显诱因下血小板减少症，为临床上常见血液病。其主要表现为血小板寿命缩短、数量减少及骨髓巨核细胞增多。研究表明，ITP与交叉反应所引起的体液免疫和细胞免疫异常有关，尤其T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞的变化与ITP的发病、治疗效果密切相关。而脾脏则是破坏血小板的主要场所，脾切除则可减少免疫系统异常，减少抗体的产生，迅速升高血小板含量，为治疗激素无效性ITP的主要方式。为了进一步探究ITP的发生机制，向临床提供更有效的治疗方式，本研究通过对ITP患者的外周血小板抗体及T淋巴细胞亚群的变化情况进行分析，现总结报道如下：1资料与方法1.1临床资料抽取2013年5月至2014年5月我院腹腔镜脾切除术成功的ITP患者87例作为研究对象，按照手术前后分别予所有患者以治疗前组与治疗后组命名。另抽取36例健康志愿者作为对照组。87例患者中男46例，女41例，年龄9-68岁，平均（30.3±12.4）岁。病程6-25天，平均（3.5±1.1）天。患者皮肤和黏膜出血情况各异，其中牙龈出血10例，肺出血2例，便血5例，鼻出血19例。所有患者诊断结构均符合血小板计数＜100×109，排除继发性血小板减少性疾病。健康志愿者中男21例，女15例，年龄12-66岁，平均（32.7±11.9）岁。1.2试剂及仪器流式细胞仪：型号BDFACSCALIBUR，BDBioscience(U.S.A.)低速离心机：型号TDZ6B,上海卢湘仪器有限公司螺旋振荡器：型号ZX21，TY10美国Stovall主要试剂：GoatF(ab’)2IgG-FITC/GoatF(ab’)2Anti-HumanIgA/GoatF(ab’)2Anti-HumanIgG/GoatF(ab’)2Anti-HumanIgM;单克隆三色抗体CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC51.2方法：1.2.1标本采集空腹状态，无菌操作下一次性采集受试者外周静脉血4ml,以EDTA抗凝后分开各2ml置于两根试管中，迅速送至流式细胞室。1.2.2流式细胞术检测外周血血小板相关抗体①试剂配置，检查样本是否凝血；②取各受试者抗凝全血1ml,低速离心，洗涤血小板后以CD41-PE进行荧光标记；③分别以GoatF(ab’)2IgG-FITC/GoatF(ab’)2Anti-HumanIgA/GoatF(ab’)2Anti-HumanIgG/GoatF(ab’)2Anti-HumanIgM进行单克隆抗体标记，洗涤后待上机检测；④调试流式细胞仪，检测样本中1000个细胞，读取记录PAIgG、PAIgA、PAIgM平均值。1.2.3流式细胞术检测T淋巴细胞亚群①取各受试者抗凝全血100μl,以CD41-PE进行荧光标记；②分别以单克隆三色抗体CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5对血小板进行标记；③洗涤后上机待测；④调试流式细胞仪，以血小板设门，检测细胞1000个，读取记录CD3+、CDD3+CD4+、CD16+56+、CD3+CD8+、CD19+亚群的百分数。1.3统计学处理对文中所得数据进行统计学处理，采用SPSS15.0软件进行分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为有统计学意义。2结果：2.1各组外周血小板相关抗体水平比较检测分析三组受试者的血小板及外周血小板相关抗体如表-1，表中显示治疗前组的PLT计数明显小于治疗后组与对照组。治疗前组的PAIgA、PAIgG、PAIgM水平显著高于治疗后组与对照组，而治疗后组与对照组的相关抗体水平相比，均有P＞0.05，无统计学意义。表-1三组血小板及外周血小板相关抗体水平检测组别PLTPAIgGPAIgAPAIgM治疗前组（n=87）82.1±22.88.66±2.9116.03±5.826.33±3.12治疗后组（n=87）143.5±34.8*1.56±0.99*1.73±0.44*1.65±0.62*对照组（n=36）172.6±60.9*1.43±0.79*1.62±0.43*1.68±0.54*注：*表示与治疗前相比，差异具有统计学意义，P＜0.05.2.2各组T细胞亚群水平的比较统计分析各组T细胞亚群水平如表-2.表中显示治疗前组的CD3+、CDD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+、CD16+56+的百分比均低于治疗后组及对照组，而治疗后组与对照组的各项指标比较，均有P＞0.05，无统计学意义。表-2各组T细胞亚群水平变化（%）组别CD3+CDD3+CD4+CD3+CD4+/CD3+CD8+CD16+56+治疗前组（n=87）58.11±12.5729.68±7.510.78±0.349.02±4.98治疗后组（n=87）66.43±11.32*43.12±7.87*1.54±0.71*16.22±7.86*对照组（n=36）70.88±10.21*38.73±8.54*1.56±0.64*16.22±7.86*注：*表示与治疗前相比，差异具有统计学意义，P＜0.05.2.3各组T细胞亚群水平变化比较各组受试者的CD3+CD8+、CD19+的百分比如表-3，表中显示治疗前组CD3+CD8+、CD19+百分比均大于治疗后组与对照组。而治疗后组与对照组各项指标相比，均有P＞0.05，无统计学意义。表-3各组T细胞亚群水平变化（%）组别CD3+CD8+CD19+治疗前组（n=87）39.01±8.2625.19±0.56治疗后组（n=87）29.92±7.32*14.07±6.25*对照组（n=36）25.33±5.82*12.08±5.62*注：*表示与治疗前相比，差异具有统计学意义，P＜0.05.3讨论ITP可分为特发性与继发性免疫性血小板减少性紫癜，继发性免疫性血小板减少性紫癜可由药物诱导、免疫功能缺陷等引起。特发性免疫性血小板减少性紫癜在临床上常无明显诱因，其诊断常为排除性诊断。ITP发病多见于儿童，无性别差异，其通过短期激素治疗可自行痊愈，而部分患者则发展为慢性ITP。对于药物治疗无效的患者，临床上常采用脾切除术进行治疗，脾切除可干预PLT的损伤机制，明显改善PLT的不断恶化减少，为治疗ITP的有效方式。ITP的发病机制及病因的探索在ITP的治疗中起到举足轻重的作用。随着医学的不断进步，医学界对ITP的发病机制及病因的研究水平得到进一步提高。研究表明，体液免疫异常为ITP发病重要因素。单核-巨噬细胞通过识别血小板表面特异性抗原以刺激淋巴细胞产生相应抗血小板抗体，从而介导血小板的损伤、血小板产生减少及骨髓巨核细胞结构功能异常。血小板表面抗原分为血小板相关抗原与血小板特异性抗原，血小板相关抗原与其他组织细胞共有，无特异性，而血小板特异性抗原则为血小板表面特异性糖蛋白。经抗原诱导，体内B细胞突变并增值克隆，导致大量抗血小板糖蛋白抗体产生，从而介导血小板的死亡。本研究显示治疗前组的PAIgA、PAIgG、PAIgM水平显著高于治疗后组与对照组，可见ITP患者体液免疫亢进，相关抗体大量产生。由上述可知，ITP患者外周血中CD3+、CDD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+、CD16+56+百分比异常减少，而CD3+CD8+、CD19+百分比则显著增高，可见细胞免疫亦为ITP的发病另一重要因素。研究表明，CD4+T细胞表面GPIIb/IIIa受体暴露可刺激B细胞产生抗血小板抗体。其中CD4+细胞可促进体液及细胞免疫，而CD8+细胞则可抑制免疫系统，本研究中CD3+CD4+/CD3+CD8+比值的降低提示存在免疫功能损伤，其与血小板异常抗体的产生密切相关。同时，ITP患者手术前NK细胞百分数显著低于手术后，正常情况下NK细胞可抑制B细胞的异常增殖，调节免疫功能，而NK细胞的减少提示ITP患者可通过降低NK细胞比例以活化B细胞而产生过强的免疫反应。脾脏为人体最大的外周淋巴器官，对体液免疫与细胞免疫起到决定性的作用。脾脏可调节外周淋巴细胞，为CTL的主要储存场所。而淋巴细胞亚群分化异常使CTL百分比增高，进而介导PLT的损伤破坏。本研究表明脾切除术前后患者的T淋巴细胞亚群差异显著，尤其CD3+及CTL百分比的下降提示脾切除可减少CTL百分比，进而减少PLT的损伤。上述可知手术后大部分患者的PLT高于手术前，即使PLT计数升高不明显，患者自诉出血症状亦在一定程度上减轻。综上所述，体液免疫及细胞免疫异常为ITP发病重要因素，腹腔镜前后T淋巴细胞亚群的改变可反映该病的病理过程，且可联合相关抗体检测用于ITP的诊断及疗效评估。因此，T淋巴细胞亚群水平的检测对了解ITP的发病情况，判断其疗效及预后具有重要的意义。参考文献[1].赵海丰,张翼鷟.CD4+CD25+调节性T细胞在免疫性血小板减少症发病中的研究进展[J].天津医药.2014(04):390-2.[2].MaL,ZhouZ,WangH,ZhouH,ZhangD,LiH,etal.IncreasedexpressionsofDNAmethyltransferasescontributetoCD70promoterhypomethylationandoverexpressionofCD70inITP[J].MolecularImmunology.2011,48(12–13):1525-31.[3].赵海丰,张翼鷟.CD4~+CD25~+调节性T细胞在免疫性血小板减少症发病中的研究进展[J].天津医药.2014(04):390-2.[4].张洋,瞿文,阮二宝,付蓉,王国锦,刘鸿,etal.免疫性血小板减少症患者骨髓滤泡辅助性T细胞数量及功能的研究[J].中国实验血液学杂志.2014(03):758-61.[5].JinC,JiaY,JinC,DongH,ChengP,ZhouJ,etal.TherapeuticeffectofHalofuginoneonITPmicebyregulatingthedifferentiationofThcellsubsets[J].InternationalImmunopharmacology.2014,18(2):213-6.[6].张春梅,滕清良,孙兆刚,郭冬梅.ITP患者骨髓淋巴细胞共刺激分子表达及相关研究[J].中国现代医学杂志.2014(22):35-7.[7].伍昌林,朱奕,王前,郑磊.特发性血小板减少性紫癜患者外周血CD1d~((hi))CD5~+CD19~+调节性B细胞的变化及意义[J].临床检验杂志.2013(03):181-3.[8].FujitaS,NakanishiT,YoshimuraH,HottaM,NakamichiN,TamakiT,