微生物的利用

《微生物的利用》复习建议中华中学张鸿亮2010年2月2010年南京市高三生物学教师培训一、我们的思考•今年公布了《江苏省普通高中生物课程标准教学要求》（修订稿），我们核心组老师在岑老师带领下进行了认真学习，特别注意学习其中修改的内容，我们认为修改的内容虽然不一定就在今年高考中体现，但我们应该加以重视，就增加的“微生物的利用”内容来说，与基因工程、蛋白质工程、细胞工程、肺炎双球菌转化实验等关系密切，应该在二轮复习中带领学生适当复习。修订版《省教学要求》4.1微生物的利用具体内容标准学习要求进行微生物的分离和培养简述培养基的用途和种类说出培养基的基本成分简述无菌技术的概念含义说出消毒与灭菌的区别尝试制备牛肉膏蛋白胨固体培养基尝试通过平板划线法纯化一种微生物二、有关内容•1、培养基的用途和种类•（1）培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。不同种类的培养基具有不同的用途。•（2）培养基的种类：有多种分类方法。•按培养生物区分：细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基；•按培养基成分区分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基；•按培养基物理状态区分：液体培养基、半固体培养基、固体培养基；•按培养基功能区分：基础培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基。•天然培养基——是用化学成分并不十分清楚或化学成分不恒定的天然有机物质配制而成培养基。常用的有机物有牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、麦芽汁、豆芽汁、玉米粉、麸皮、牛奶、血清等。如实验室常用于培养细菌的牛肉膏蛋白胨培养基，及培养酵母菌的麦芽汁培养基等就属于此类培养基。•合成培养基——是用化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。•半合成培养基——是指一类主要用已知化学成分的试剂配制，同时又添加某些未知成分的天然物质制备而成的培养基。•基础培养基——含有一般微生物生长繁殖所需基本营养成分的培养基称为基础培养基。牛肉膏蛋白胨培养基就是基础与应用研究中常用的基础培养基。在基础培养基中加入某些特殊需要的营养成分，可构成不同用途的其它培养基，以达到更有利于某些微生物生长繁殖的目的。•加富培养基——指在基础培养基中加入某些特殊需要的营养成分配制而成的营养更为丰富的培养基。加富培养基一般用于培养对营养要求比较苛刻的微生物。在研究致病微生物时常采用加富培养基。如培养某些致病菌常需要在基础培养基中加入血液、血清或动物与植物的组织液等。•选择性培养基——用于从混杂的微生物群落中选择性地分离某种或某类微生物而配制的培养基称为选择性培养基。选择性培养基配制时可根据不同的用途选择特殊的营养成分或添加特定的抑制剂，以达到分离特定微生物的目的。在实践中有两种方式，一种是正选择，另一种是反选择。正选择是添加某种特定成分为培养基主要或唯一的营养物，以分离能利用该种营养物的微生物。反选择是在培养基中加入某种或某些微生物生长抑制剂，以抑制所不希望出现的微生物，从而从混杂的微生物群体中分离不被抑制和所需要的目标微生物。•鉴别培养基——用于鉴别不同微生物类型微生物的培养基称为鉴别培养基。鉴别培养基主要用于微生物的分类鉴定和分离或筛选产生某种或某些代谢产物的微生物菌株。如要了解某种微生物利用葡萄糖时是否产酸，就在葡萄糖为唯一碳源的培养基中加入一定量的1%溴麝香草酚蓝酒精溶液，溴麝香草酚蓝是一种在pH6.8左右时呈浅草青色，pH低于6.6时变黄，pH高于7.0时变蓝的指示剂。当培养的细菌能利用葡萄糖产酸，则使培养基呈酸性而变黄色，从而利用葡萄糖产酸这一生理生化特性得以被鉴定。2.培养基的成分•通常包括碳源、氮源、生长因子、无机盐和水等5类。•（1）凡可被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳架来源的营养物通称碳源。•微生物能利用的碳源的种类及形式极其广泛多样，既有简单的无机含碳化合物如CO2和碳酸盐等，也有复杂的天然有机化合物，如糖与糖的衍生物、醇类、有机酸、脂类、烃类、芳香族化合物以及各种含氮的有机化合物。其中糖类通常是许多微生物最广泛利用的碳源与能源物质；其次是醇类、有机酸类和脂类等。•（2）能被微生物用来构成微生物细胞组成成分或代谢产物中氮素来源的营养物通称为氮源。•有机含氮化合物包括尿素、胺、酰胺、嘌呤、嘧啶、蛋白质及其降解产物——多肽与氨基酸等，均可被不同微生物所利用。其中蛋白质水解产物是许多微生物的良好氮源。大多数微生物能利用无机含氮化合物，如铵盐、硝酸盐和亚硝酸盐等，但仅有固氮微生物可利用分子态氮作氮源。•（3）为某些微生物生长所必需、其自身又不能合成、需要外源提供但需要量又很小的有机物质通称为生长因子。•狭义的生长因子一般仅指维生素。广义的生长因子除了维生素外，还包括氨基酸类、嘌呤和嘧啶类以及脂肪酸和其他膜成分等。•生长因子虽是一种重要的营养要素，但它与碳源、氮源不同，并非任何一种微生物必须从外界吸收的。通常由于对某些微生物生长所需的生长因子要求不了解，因此常在培养这些微生物的培养基里加入酵母膏、牛肉膏、玉米浆、肝浸液、麦芽汁或其他新鲜的动植物组织浸出液等物质以满足它们对生长因子的需要。•（4）根据微生物生长繁殖对无机盐需要量的大小，可分为大量元素和微量元素两大类。••（5）水在微生物机体中具有重要的功能，是维持微生物生命活动不可缺少的物质：①水是微生物细胞的重要组成成分，占微生物体湿重的70％～90％，水还供给微生物氧和氢两种元素。②水是物质代谢的原料，如一些加水反应过程，没有水将不能进行。③水作为一种溶剂，能起到胞内物质运输介质的作用，营养物质只有呈溶解状态才能被微生物吸收、利用，代谢产物的分泌也需要水的参与。④水又是热的良好导体，因为水的比热高，故能有效地吸收代谢过程中放出的热并将其迅速散发，以免胞内温度骤然升高，故而水能有效地控制胞内温度的变化。3.无菌技术的概念含义•无菌技术即是指在微生物实验中排除所有杂菌污染的一系列措施，要求实验者在思想上树立深刻的无菌概念，技术上要求实验者进行无菌操作时必须严格熟练。•凡防止一切微生物侵入,保持灭菌物品及无菌区不再受污染的操作方法称为无菌技术,它既包括灭菌、抗菌等一系列硬措施,也包括相应的操作与管理制度等软措施。4.消毒与灭菌的区别•消毒——杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽孢的细菌或非病原微生物。用以消毒的药品称为消毒剂。•灭菌——杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽孢在内的全部微生物。•实验者的手只能消毒不能灭菌。空白培养基需要灭菌，不能消毒。接种时采用无菌操作，接种后不能再灭菌。5.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基•一、目的要求•1．明确培养基的配制原理•2．通过对微生物培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。•二、基本原理•培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水）。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制。•三、器材•牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCL；试管，烧杯，量筒，玻棒，天平，铁架台、玻璃漏斗、细橡皮管、弹簧夹，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布，蒸馏水等。•四、操作步骤•（一）培养基配制•1．称量•依次准确地称取0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl，2g琼脂，将前3种放入烧杯。•2．溶化•在上述烧杯中可先加入100mL蒸馏水，用玻棒搅匀后，在酒精灯上方的石棉网上加热使其溶化，溶化后加入琼脂，再用微火边加热边不停搅拌，待琼脂溶化后补加蒸馏水至100mL。•3．调pH•在未调pH前，先用pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至达到所需pH值。反之，则用1mol/LHCL进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。•pH调至7.5左右。•4．培养基的分装•按实验要求，可将调好pH的培养基趁热分装入试管内和培养皿内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。•（1）分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，便于灭菌后制成斜面不超过1/2。•（2）分装培养皿的量不超过培养皿容积的一半为宜，准备接种。•5．加塞•培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞，以防止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。棉塞需塞入其2/3。•6．包扎•加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、班级、姓名、日期和上下。•（二）灭菌•98kPa，20分钟高压蒸汽灭菌。注意几点：•（1）灭菌锅内加水，最好用热水。•（2）放试管时注意试管口朝上，不能排得过挤。•（3）加盖旋紧螺栓时要两两对称拧紧。•（4）接通电源，上升到49kPa时，要打开排气阀放气至0，关闭排气阀，再重复一次。•（5）20分钟后切断电源，压力降到0时，打开排气阀，10分钟后再开盖。•（三）搁置斜面•将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在放倒的试管架上或木棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。•（四）接种•省教学要求中没有作要求，可以不做。6.通过平板划线法纯化一种微生物•按照制作牛肉膏蛋白胨培养基方法制成平板。•凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－1）在平板上划线。1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于28～300C温室培养。2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。制平板：每组制培养皿3付。在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度、组别、班级。•在平板上挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。•接种到斜面培养基时，可再采用划线法，在斜面上划蛇形曲线。•（1）接种前，要将接种环在火焰上方灼烧后，在含有菌种的培养皿边缘冷却后取菌落中少量菌，到平板或试管的斜面划线。•（2）不论平板划线还是斜面划线都要注意既要快速划又不能划破培养基。分离与纯化微生物的基本原理•在自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的，为了生产和科学研究的需要，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出它，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯化。•为了获得纯种的微生物，一般根据该微生物营养或培养特点，或对某种抑制剂的耐受性不同，或对某种环境条件要求不同，从而制作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。结束语•以上是自己在带领学生实验和再学习后的内容，由于本人水平限制，可能存在不全面之处，欢迎大家批评指正。谢谢！