微生物的感染与致病

48第七章微生物的感染与致病[内容提要]细菌是否有致病性，经典的依据是柯赫法则，近年来提出的分子水平的柯赫法则对此标准作了补充和完善。就某种病原菌而言，其致病性一般通过测定LD50来定量。细菌的致病性在很大程度上取决于其毒力因子，包括侵袭力与毒素，以及毒力因子的分泌系统。侵袭力导致病原菌在机体内定殖、突破机体的防御屏障、内化作用、繁殖与扩散。毒素有外毒素与内毒素之分，外毒素是具有特异性毒性作用的蛋白质，典型结构为A-B亚单位的聚体。内毒素为LPS的类脂A，耐热，具致热作用等。细菌致病性的现代观点是将病原菌、宿主及二者的相互的作用综合考虑，纠正了只调节细菌本身的片面性，是认识的深化。细菌的毒力可用人工的方法增强或减弱，并受到温度、离子浓度等多种环境因子的调节。感染（infection）是指病原微生物在宿主体内持续存在或增殖。发病（disease）表示病原微生物感染之后，对宿主造成明显的损害。病原菌（pathogenicbacteria）是指那些导致机体发病的细菌。是一群高度特化了的微生物，为了自身的生存，已适应而且必须在宿主生物体内持续存在或增殖，有时可造成宿主发病。从进化关系来看，病原菌是由非病原菌演变而来，它们之间没有绝对的界限。就病原菌的生活方式而言，绝大多数病原菌是寄生性的，又可分为专性寄生和兼性寄生两大类。另有一些是寄居性的，在正常情况下对寄主不呈现致病作用，如动物肠道的大肠杆菌、皮肤上的化脓性链球菌等，当动物机体抵抗力降低时可致病，称为条件性病原菌或机会性病原菌。还有少数是腐生性的，是在死物上生长繁殖产生毒素，毒素以食物等为媒介进入人和动物体而致病，如肉毒中毒等毒素性食物中毒等，称其为腐生性病原菌。微生物学研究侧重于感染。因为感染的范围更广，发病仅仅是感染可能出现的后果之一。感染不一定都导致发病，而发病则离不开感染。如将防治传染病的重点转移到预防感染，则可收到事半功倍之效。第一节细菌的致病性和毒力病原菌能否引起宿主疾病取决于它们的致病性和毒力。一定种类的病原菌，在一定的条件下能在特殊的宿主体内引起特定疾病的能力称为致病性（pathogenicity）。细菌的致病性是针对宿主而言，有的仅对人致病，有的则仅对某些动物致病，而有的则对兼而有之。不同的病原菌对宿主可引起不同的疾病，表现为不同的临床症49状和病理变化，也就是说某种病原菌只能引起一定的疾病。因此，致病性是细菌种的特征，是质的概念。同一细菌不同菌株间的致病能力有所差异。病原菌致病力的强弱程度称为毒力(virulent)，据此有强毒、弱毒（减毒）和无毒之分。因此，毒力是菌株个体的特征，是量的概念。一、细菌致病性的确定（一）经典柯赫法则著名的柯赫法则（Koch’spostulates）是确定某种细菌是否具有致病性的主要依据，其要点是，第一，特殊的病原菌应在同一疾病中查见，在健康者不存在；第二，此病原菌能被分离培养而得到纯种；第三，此纯培养物接种易感动物，能导致同样病症；第四，自实验感染的动物体内能重新获得该病原菌的纯培养。柯赫法则随在确定一种新的病原体时非常重要，但其有一定的局限性，某些情况并不符合该法则。如健康带菌或隐性感染，有些病原菌迄今仍无法在体外人工培养，有的则没有可用的易感动物。另外，该法则只强调了病原微生物一方面，忽略了它与宿主的相互作用，是不足之处。（二）基因水平的柯赫法则随着分子生物学的发展，“基因水平的柯赫法则”（Koch’spostulatesforgenes）应运而生。其要点是：第一，应在致病菌株中检出某些毒力或其产物，而无毒力菌株中则无；第二，如有毒力菌株的某个基因被损坏，则菌株的毒力应减弱或消除。或者将此基因克隆到无毒菌株内，后者成为有毒力菌株；第三，将细菌接种动物时，这个基因应在感染的过程中表达；第四，在接种动物检测到这个基因产物的抗体，或产生免疫保护。该法则也适用于细菌以外的微生物，如病毒。二、细菌毒力的测定在疫苗研制、血清效价测定、药物筛选等工作中，都必须知道细菌的毒力。细菌毒力的表示方法很多，最具实用的是半数致死量和半数感染量。（一）半数致死量（medianlethaldose,LD50）是指能使接种的实验动物在感染后一定时限内死亡一半所需的微生物量或毒素量。测定LD50应选取品种、年龄、体重乃至性别等各方面都相同的易感动物，分成若干组，每组数量相同，以递减剂量的微生物或毒素分别接种各组动物，在一定时限内观察记录结果，最后以生物统计学方法计算出LD50。由于半数致死量采用了生物统计学方法对数据进行处理，因而50避免了动物个体差异造成的误差。（二）半数感染量（medianinfectiousdose,ID50）是指感染实验动物、鸡胚或细胞后在一定时限内使一半感染发病所需的微生物量。因某些病原微生物只能感染实验动物、鸡胚或细胞，但不引致死亡，只能用ID50来表示其毒力。测定的方法与测定LD50类似，只不过在统计结果时以感染者代替死亡者。第二节细菌的毒力因子及分泌系统构成细菌毒力的物质称为毒力因子（virulentfactor），主要有侵袭力和毒素，此外有些毒力因子尚不明确。近年来的研究发现，细菌的许多重要毒力因子的分泌与细菌的分泌系统有关。一、侵袭力（invasiveness）病原菌在机体内定殖，突破机体的防御屏障，内化、繁殖和扩散的能力称为侵袭力。（一）定殖（colonization）细菌感染的第一步就是在体内定殖（或称定居），实现定殖的前提是细菌要粘附在宿主消化道、呼吸道、生殖道、尿道及眼结膜等处，以免被肠蠕动、粘液分泌、呼吸道纤毛运动等作用所清除。凡具有粘附作用的细菌结构成份统称为粘附素（adhesin），通常是细菌表面的一些大分子结构成份，主要是革兰氏阴性菌的菌毛，其次是非菌毛粘附素，如某些外膜蛋白（OMP）以及革兰氏阳性菌的脂磷壁酸（LTA）等。细胞或组织表面与粘附素相互作用的成份称为受体（receptor），多为细胞表面糖蛋白，其中的糖残基往往是粘附素直接结合部位，如大肠杆菌1型菌毛结合D甘露糖、霍乱弧菌的4型菌毛结合岩藻糖及甘露糖、大肠杆菌的F5（K99）菌毛结合唾液酸和半乳糖。部分粘附素受体为蛋白质，最有代表性的是细胞外基质（extracellularmatrix,ECM），ECM的成员有1型及4型胶原蛋白（collagen）、层粘连蛋白（laminin）、纤粘蛋白（fibronectin）等，如金黄色葡萄球菌的粘附素胶胡原合蛋白受体为胶原蛋白。（二）干扰或逃避宿主的防御机制病原菌粘附于细胞或组织表面后，必须克服机体局部的防御机制，特别是要干扰或逃避局部的吞噬作用及分泌抗体介导的免疫作用，才能建立感染。1.抗吞噬作用：包括以下几个方面。第一，不与吞噬细胞接触，可通过胞外酶（如链球菌溶血素等）破坏细胞骨架以抑制吞噬细胞的作用。第二，抑制吞噬细胞的摄取，如多糖荚51膜、链球菌的M蛋白和菌毛。第三，在吞噬细胞内生存，如沙门氏菌的某些成份可抑制溶酶体与吞噬小体的融合；再如李氏杆菌被吞噬后，很快从吞噬小体中逸出，直接进入细胞质。而金黄色葡萄球菌则产生大量的过氧化氢酶，能中和吞噬细胞中的氧自由基。第四，杀死或损伤吞噬细胞，细菌通过分泌外毒素或蛋白酶来破坏吞噬细胞的细胞膜，或诱导细胞凋亡，或直接杀死吞噬细胞。2.抗体液免疫机制：细菌逃避体液免疫主要通过：第一，抗原伪装或抗原变异，前者主要是在细菌表面结合机体组织成份，如金黄色葡萄球菌通过细胞结合性凝固酶结合血纤维蛋白，或通过SPA结合免疫球蛋白。第二，分泌蛋白酶降解免疫球蛋白，嗜血杆菌等可分泌IgA蛋白酶，破坏粘膜表面的IgA。第三，通过LPS、OMP、荚膜及S层等的作用，逃避补体，抑制抗体产生。3.内化作用（internalization）：指某些细菌粘附于细胞表面之后，能进入吞噬细胞或非吞噬细胞内部的过程（图5-1）。细菌一旦丧失进入细胞的能力，毒力则显著下降。内化作用对细菌的意义在于，细菌通过这种移位作用进入深层组织，或进入血循环，细菌借以从感染的原发病灶扩散至全身或较远的靶器官。宿主细胞为进入其内的细菌提供了一个增殖的小环境和庇护所，使细菌逃避宿主免疫机制的杀灭。4.在体内增殖：细菌在宿主体内增殖是感染的核心问题，增殖速度对致病性极其重要，如果增殖较快，细菌在感染之初就能克服机体防御机制，易在体内生存。反之，若增殖较慢，则易被机体清除。铁是许多细菌生长所必需，然而宿主体内无游离铁存在，细菌通过获铁系统为细菌生长提供所需的铁，获铁系统包括生产和利用载铁体或直接利用宿主的含铁化合物，如血红转铁蛋白、乳铁蛋白等。赤藓醇（erythritol）能刺激布氏杆菌在体内的生长。雄性及妊娠母畜生殖系统中有赤藓醇存在，因此布氏杆菌可在其中大量增殖，其感染局限于生殖系统。5.在体内扩散：细菌分泌的蛋白酶称为胞外蛋白酶（extracellularproteinase），它们具有图5-1鼠伤寒沙门氏菌内化作用过程示意（据Salyers等）52多种致病作用，例如激活外毒素、灭活血清中的补体等，有的蛋白酶本身就是外毒素。此外，最主要的作用是作用于组织基质或细胞膜，造成它们的损伤，增加其通透，有利于细菌在体内的扩散性。此类常见的有1．透明质酸酶（hyaluronidase），旧称扩散因子（spreadingfactor），分解结缔组织的透明质酸。2．胶原酶（collagenase），主要分解ECM中的胶原蛋白。3．神经氨酸酶（neuraminidase），主要分解肠粘膜上皮细胞的细胞间质。4．磷脂酶（phospholipase）（α毒素），可水解细胞膜的磷脂。5．卵磷脂酶（lecithinase），分解细胞膜的卵磷脂。6．激酶（kinase），能将血纤维蛋白溶酶原激活为血纤维蛋白溶酶，以分解血纤维蛋白，防止形成血凝块。7．凝固酶（coagulase），细菌在体内的扩散也可通过内化作用完成。特别是细胞结合性凝固酶，可为细菌提供抗原伪装外，使之不被吞噬或机体免疫机制所识别。二、毒素（toxin）细菌毒素按其来源、性质和作用等的不同，可分为外毒素和内毒素两大类。在大多数情况下，外毒素一般简称毒素。（一）外毒素（exotoxin）是某些病原菌在生长繁殖过程中所产生的对宿主细胞有毒性的可溶性蛋白质。大多数外毒素在菌体内合成后必须分泌于胞外，故名“外毒素”。但也有少数外毒素存在于菌体细胞的周质间隙，只有当菌体细胞裂解后才释放至胞外。1.特性：①外毒素通常具有菌种特异性；②外毒素的毒性作用极强；③外毒素的毒性具有高度的特异性；④外毒素具有良好的免疫原性；⑤多数外毒素不耐热；⑥外毒素都是蛋白质，具有酶的催化作用。不同细菌产生种特异性的外毒素，如破伤风梭菌产生破伤风毒素、炭疽杆菌产生炭疽毒素、霍乱弧菌产生霍乱毒素等。1mg纯化的肉毒毒素能杀死2000万只小鼠。破伤风毒素对小鼠的致死剂量，是马钱子碱的106倍。不同细菌产生的外毒素，对机体的组织器官有一定的选择作用，引起特征性的病症。如破伤风毒素作用于脊髓前角运动神经细胞，引起肌肉的强直性痉挛；肉毒毒素作用于眼神经和咽神经，引起眼肌和咽肌麻痹（图5-2）；但霍乱弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、气单胞菌等许多细菌均可产生作用类似的肠毒素。外毒素可刺激机体产生特异性的抗体，而使机体具有免疫保护作用。这种抗体称为抗毒素（antitoxin），可用于紧急治疗和预防。外毒素在0.4%甲醛溶液作用下，经过一段时间使其毒性丧失，但仍保留原有抗原性，称之为类毒素（toxoid）。类毒素仍可刺激机体产生抗毒素，53可作为疫苗进行免疫接种。多数外毒素一般在60℃~80℃经10min~80min即可失去毒性，但也有少数例外，如葡萄球菌肠毒素及大肠杆菌热稳定肠毒素（ST）能耐100℃30min。外毒素易被热、酸及蛋白水解素酶灭活，许多外毒具有酶的催化作用，有很高的生物学活性和特异性。2.组成：大多数外毒素由A、B两种亚单位组成，有多种合成和排列形式（图5-3）。A亚单位为毒素的活性中心，称活性亚单位，决定毒素的毒性效应。B亚单位称结合单位，能使毒素分子特异性地结合在宿主易感组织的细胞膜