K-ras野生型大肠癌发生与MAPK

二、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。关于大肠癌的发生，长期以来认为有两种学说，即：adenoma-carcinoma-sequence学说［１］(先有良性腺瘤，之后一部发生癌变)和denovo学说［２］(直接从正常粘膜发生癌变)。Vogelstein于1988年对正常组织·腺瘤·癌组织进行了详细解析，完成了adenoma-carcinoma-sequence(polyp-carcinomasequence)的多阶段发癌模型［１］，即：在小的腺瘤阶段C-myc发生异常，随着腺瘤增大K-ras基因出现点突变及P53，DCC等基因异常使肿瘤的一部分发生癌变。这一机制基本清楚。而denovo型发癌机制还不清楚。日本学者藤盛孝博教授(申请者的指导教授)的分子生物学实验结果揭示，在denovo型发癌过程中，K-ras基因基本不参与，此型癌的发生可能是由K-ras以外的其他未知的癌基因参与所致。Ras基因作为人类大肠癌发癌的重要基因被广泛研究。现已发现，K-ras基因的突变(K-ras活性型)在人大肠癌的检出率为40-50%［4，5］，而其余50-60%的不伴有K-ras基因点突变(K-ras野生型)大肠癌(其中一部为denovo型发癌者)的发生被认为是由K-ras基因以外的未知癌基因所致［３］。研究证明，Ras基因作为细胞增殖与分化的信号传导启动子起重要作用。它的靶蛋白有Raf、MEKK及P2-3激酶等。其中，古典的MAPK(mitogen-activatedproteinkinase)信号传导系(Ras→Raf-1→MEK→MAPK)在细胞增殖，分化及发癌过程中起重要作用。它们具有传导上位特异的激酶依次磷酸化和激活下位特异激酶的特性。即：Ras活性型激活Raf(MAPKKK),Raf激活MEK(MAPKK)，MEK激活MAPK。然后，由小分子的MAPK将信息转入细胞核内，引起细胞核内染色体改变。因此，MAPK的活性可能在细胞质和细胞核的信号传递中起到一个连接作用［５］。新近的研究提示“MAPK的活性异常可能与发癌有关［6，7］。一些纤维母细胞株的实验结果提示，作为MAPK的新家族成员的JNK(c-Jun·N-terminalKinase)信号传导系也受Ras活化的影响，可能参与Ras活性型细胞癌变［8。9］。近年的研究虽然提示MAPK，JNK参与了细胞癌变，但人大肠癌与K-ras·Raf-1·MEK·MAPK以及与JNK传导系间关系尚不清楚［10。11。12，13，14］。尤其是K-ras野生型及K-ras活性型大肠癌与MAPK及JNK信号传导系间关系方面的研究尚未见报道。倘若在大肠癌中(尤其在K-ras野生型)发现有MAPK或JNK等蛋白激酶信号传导异常(蛋白过表达，磷酸化或发现其点突变)，将会对阐明大肠癌的发生机制，特别是为探讨K-ras野生型大肠癌、denovo型癌发生机制提供有力依据。此乃本项目的主要意义所在。近来研究还表明大肠癌的K-rascodon13点突变与大肠癌预后有关［１5］。就是说K-ras基因变异可能是判定大肠癌预后一个重要指标。在我们最近的实验中，不论在大肠癌细胞株，还是在大肠癌组织内均发现了MAPK的活性。有趣的是，K-rasCodon13有突变的大肠癌组织及细胞株内MAPK活性均低于正常组织。这些都提示此类型大肠癌的癌变可能是通过不同于Ras/MAPK途径的其它方式(JNK?)发生的；与K-ras有关的MAPK及JNK信号传导蛋白激酶可能参与了大肠癌的发生，可能会对大肠癌的分期、病理类型、转移和预后的判定提供分子生物学依据，对这些问题的探讨也是本研究的目的和意义之一。－3-1－对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。1.Vogelstein.B.,Fearon,E.R,.Bos,J.L.Geneticalterationduringcolorectal-tumordevelopment.NewEngl.J.Med,1988,319:525-523.2.FearonER,VogelsteinB.Ageneticmodelforcolorectaltumorigenesis.Cell,1990,61:759-767.3.Bedenne.L.Faivre,J.Hillon,P.Adenoma-carcinomasequenceor“denovo”carcinogenesis?Cancer,1992,69:883-888.4.TakahiroFujimori,Kazuhirosatonaka,SakanMaeda.Non-involvementofrasmutationsinflatcolorectaladenomasandcarcinomas.Int.J.Caner,1994,57:51-55.Bo,J.L.,Fearon,E.R.,Hamiton,S.R.Prevalenceofrasgenemutationsinhumancolorectalcancers.Nature,1987,327:293-297.6.Forrester,K.,Almoguera,C.,Han,K.DetectionofhighincidenceofK-rasoncogenesduringhumancolontumorigenesis.Nature,1987,327:298-303.7.SallyC.,Hugh,P.,ChristopherJ.M..ActivationofMAPKinaseKinaseisnecessaryandsufficientforPC12differentiationandfortransformationofNIH3T3cells.Cell,1994,77:841-852.8.胡长灯戚晓东片冈澈.EffectofphosphorylationonactivitiesofRaplAtointeractwithRaf-1andtosuppressRas-dependentRaf-1activation.J.BioChem.1999，274(1)：48-51.9.Heiner.S.,JieZH.,FriedeirkeG.Pituitaryadenylate-cyclase-activatingPolypeptidestimulatesproto-oncogeneexpressionandactivatestheAP-1(c-Fos/c-Jun)transcriptionfactorinAR4-2Jpancreaticcarcinomacells.Eur.J.Biochem,1996,242:467-476.10.Randall,S.F.,Kathleen,M.M.InvolvementofExtracellularsignal-regulatedKinase2andstress-activatedproteinKinase/JunN-terminalKinaseActivationbyTransformingGrowthFactorβintheNegativeGrowthcontrolofBreastcancercells.CancerResearch,1997,57:628-633.11.HiroyaOka,Yuji.Chatani,OsamuYoshida,ConstitutiveActivationofMitogen-activated-Protein(MAP)KinasesinHumanRenalcellcarcinoma.CancerResearch,1995,55:4182-41812.MarikoOhmori,SenjiShirasawa.ActivatedKi-ras/stress-activatedproteinKinaseorExtracellularsignal-regulatedKinaseActivationinHumanColonCancercells.CancerResearch.1997,57:4714-4717.13.YasushiKuno,KenKonso.Tumor-specificactivationofmitogen-activatedproteinkinaseinhumancolorectalandgastriccarcinomatissues.Jpn.J.CancerRes,1998,89:903-909.14.MiKiH.YamadaH.Mitamura,K.InvolvementofP38MAPKinaseinapoptoticandproliferativealterationinhumancolorectalcancers.AnticancerResearch19(6B):5283-91,1999Nov-Dec.15.AnthonyJ.Senagore,JenniferTheboBiener.AnewlyidentifiedpatternofK-rasmutationsatcodons12and13isassociatedwithlong-termsurvivalincolorectalcancer.Surgery1997,122:765-770.三、研究方案1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标：1)研究MAPK、JNK等信号传导系蛋白激酶的活性与K-ras野生型(K-rasWT)及K-ras活性型人类大肠癌发生的关系，探讨人大肠癌发生机制；尤其要阐明K-ras野生型大肠癌的发生机制，为研讨denovo型大肠癌发生机制提供分子生物学依据。2)比较和探讨MAPK、JNK等信号传导系蛋白激酶的活性及K-ras的变异与大肠癌的临床病理特征(病期、类型、浸润、转移及预后)的相关关系，为临床诊疗及预后判定提供分子生物学依据。研究内容：本实验通过分子生物学手段将人大肠癌(组织及细胞株)分为K-ras野生型和K-ras活性型；用特异抗体(westernblot法)测定和比较两型大肠癌的MAPK及JNK信号传导系各蛋白激酶的活性，从而探讨K-ras及MAPK·JNK信号传导系与大肠癌发生及临床病理特征的关系。一、人大肠癌的K-ras基因的分类(野生型和活性型)及分布的研究。二、测定K-ras野生型及K-ras活性型大肠癌的各自下位信号传导蛋白激酶Raf-1,MEK,MAPK等的活性水平。并比较这些蛋白激酶与此两型(尤其是K-ras野生型)大肠癌发生的相互关系。三、人大肠癌的K-rasCodon12、13、61出现的点突变与MAPK等蛋白激酶活性间的关系。四、K-rasCodon13有点突变的大肠癌与JNK信号传导系蛋白激酶活性间的关系。五、比较上述诸蛋白激酶的活性、突变与人大肠癌不同临床病理特征(病期、类型、转移及预后)的相关关系。拟解决的关键问题：1.测定K-ras野生型大肠癌的MAPK及JNK等信号传导蛋白激酶的活性方法。2.评价伴有K-rasCodon13突变的大肠癌的发生与JNK传导路径相关性及检测手段。3.大肠癌不同临床病理特征所表现在K-ras点突变及MAPK，JNK信号传导蛋白激酶活性上的分子生物学特点。－4－2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析(之一)技术路线及实验方案：将手术中获得的大肠癌组织及癌周正常粘膜迅速冷冻保存在-80℃。从癌组织及其周围正常粘膜中提取DNA，通过PCR-直接序列法测定K-rasCodon12、13、61的点突变，将其分为K-ras活性型(有K-ras基因突变者)与K-ras野生型(无K-ras基因突变者)。称等量癌及其周围正常组织行蛋白提取。使用特异抗体通过Westernblot法测定蛋白提取液中的