miRNA研究进展

SmallRNAResearchbasedonNGS姓名：刘灿学号：201311689第一章前言1.1ncRNA定义和分类ncRNA（nonecodingRNA）即不编码蛋白质的RNA。主要包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和microRNA等多种已知功能的RNA，当然还包括未知功能的RNA。根据其长度分布，我们可以将其大致分为三类：小于50nt，包括miRNA、siRNA、piRNA。在50-5oont之间，包括有rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、SRPRNA。大于500nt，包括LncRNA、mRNA-like的非编码RNA、长的不带polyA尾巴的非编码RNA等等。1.2miRNA的介绍1.2.1miRNA的定义小RNA是指一类具有调控基因表达作用的非编码的小分子RNA，其长度一般控制在18~30nt之间。miRNA（microRNA）是我们常见的小RNA之一。其长度控制在18-25nt之间，经过较长的初级转录物在一系列的核酸酶的剪切加工后形成，随后可以组装进入RNA诱导的沉默复合体，通过间几乎不配对的方式来识别mRNA，后根据互补程度的大小来知道沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏相关mRNA的翻译，从而起到抑制某目的基因表达的作用，在近10年里获得了广泛的关注与应用。1.2.2miRNA的作用特点miRNA作为内源性的单链小分子RNA，对mRNA进行转录后的表达调控。miRNA与靶mRNA只需要部分的互补就可以起到作用。预测有30%的基因会受到miRNA的调节，其中一个miRNA可以调控多个mRNA，而一个mRNA又可以收到多个miRNA的调控。1.2.3miRNA的表达特点miRNA具有较强的偏好性，5`端偏好碱基U，第10位碱基偏好A。前体长度存在种间差异，动物约为70~90nt，而植物的较长，约为130nt左右。miRNA的表达具有时空特异性，特别是组织表达的差异。miRNA中60%为独立表达，15%具有成簇表达（即表达具有相关性）的特点。虽然miRNA广泛存在与各个物种，但具有高保守性，涉及到成熟序列，种子序列以及部分物种的前体序列也是保守的，这样就为我们在新的物种中发现miRNA提供的参考价值。以let-7家族为例，其中我们在线虫中发现了4个，人的基因组中发现了15个，以及在果蝇中发现了1个。1.3miRNA的研究方向miRNA功能的发掘中miRNA的网络化研究，涉及miRNA与靶基因的交互作用和通路内miRNA的协同与竞争作用的研究，miRNA的活性研究，例如miRNA降解mRNA的效能等。近几年又新发现了一种可以调节miRNA沉默效应的RNA——circularRNA。环状RNA可以与miRNA结合，降低miRNA与mRNA的结合从而降低对mRNA的干扰作用，这主要得益于环状RNA的特异的剪接方式，在其末端有较多的重复序列。整个链上有非常丰富的miRNA结合位点，结合方式与靶基因类似但有独特的结合方式，与miRNA两端有高的匹配程度，中间匹配松散，这种结构有利于吸收miRNA并可保护本身不被miRNA降解。但不容忽视的是环状RNA作用具有海绵效应。一个cirRNA可以捕获多个miRNA，但是cirRNA的解体会在短时间内释放出很多的miRNA，miRNA的相对表达增多。释放出的miRNA依然可以作用于有相同的MRE的mRNA.第二章小RNA测序信息分析流程简介2.1方案制定真核生物目标小RNA分离及测序策略选择2.2样品检测一般浓度要求:totalRNA=200ng/ul总量要求：totalRNA=10ug2.3文库制备与测序原核生物ncRNA分离与测序应结合实际捕获灵活构建文库2.4信息分析针对原始数据先要进行质控与过滤，例如针对碱基质量，测序的错误率，并且去掉接头。并且可以根据获得的miRNA长度分布鉴定样品质量。2.4.1鉴定miRNA针对已知的miRNA，我们可以使用BLASTN，miRBase，或者match_hairpin.aln来实现查找。鉴定条件较多，例如可根据miRNA碱基偏好性。但针对在mirbase中没有收录的物种的mi人、RNA，我们可以根据成熟体miRNA的序列保守型，物种边界大小对序列保守鉴定的影响以及其存在的前体颈环结构来进行鉴定。为了排除预测干扰，通过与其他ncRNA数据库、repeat数据库以及基因组中exon数据库比较，去除这些数据（数据库Genebank、Rfam、repeat、exon、siRNA、piRNA等）。获得符合条件的数据，根据序列在基因组上的定位情况，使用mireap软件进行预测。2.4.2预测novelmiRNA前体长度一般控制在35nt左右，并且发卡结构有高度保守的模序，miRNA位于发卡结构的两臂上。NovalmiRNA的酶切位点具有保守性，且发卡前体有较低的折叠自由能。2.4.3预测靶基因在完成以上工作后，我们就可以进行靶基因的预测。我们以植物中的miRNA靶基因预测分析为例，可以设计以下的筛选条件：1）少于4个碱基的错配2）不能有任何连续的两个错配3）在10,11为不允许有错配（高度保守）4）在2-12nt见少于2.5个错配5）5`端1~12nt不允许有错配6）最小自由能不能低于成熟体的75%2.4.4靶基因功能注释与分类利用GeneOntology(GO)enrichmentanalysis和KEGGpathwayanalysis，对预测得的靶基因样品降解所致植物峰值动物峰值进行功能注释与分类，进一步了解miRNA的效用原理。第三章案例分析miRNA作为内源性的单链小分子RNA，对mRNA进行转录后的表达调控。大量的研究已经表明miRNA会控制各种鱼生物和代谢过程相关的基因。在众多模式植物中，例如拟南芥和水稻，现已经完成了更进一步miRNA的发现与功能研究，针对多种重要的经济作物，例如大豆等也进行了类似的实验与分析。本文就以花生为例，利用高通量测序技术支持，进行一系列的过滤与分析，找到了75个保守的miRNA和14个物种特有的miRNA，并通过RT-PCR进行验证，表明其中存在至少22个保守的miRNA和14个物种特有miRNA在花生生长，发育以及环境胁迫情况下起到重要的调节作用。也为未来miRNA研究提供大量可参考资源。3.1试验流程3.2实验中遇到的瓶颈测序结果在Mirbase中并没有找到对应的miRNA。3.3应对策略文章中选择数据库中收录的近源（生物进化）物种3~5个，在这个范围内收录的miRNA可以作为该物种的conservedmiRNA。构建本物种潜在的conserved数据库后，将不同物种间进行比对，选出比对效果最好的表达强度最高的序列，以此筛选出本物种中的conservedmiRNA。将筛选出的miRNA对应的成熟体序列进行二级结构预测，完成前提验证。结果文章中发现了14个新的miRNA家族和75个保守的miRNA。除了ahy-miRn1在大豆中有一个同源体以外，其它13个miRNA是没有在其它植物物种中找到同源体而被认为是物种特有的。最后通过RT-PCR分析证实了保守的和花生特有的miRNA都在花生中真实表达。值得我们注意的是，预测的miRNA，由于基因组不完整，可能会无法预测到前体，造成一部分结果的缺失。并且预测出来的信的miRNA的表达实在特定环境下和组织中表达的。