MTT的测定方法基本上是利用细胞本身的酵素对受质的作用

MTT的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。利用此一原理，也可以來測定細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸浮性細胞則較不理想，進行本實驗時應特別注意。细胞增殖的测定：四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)[3]：选择对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化5～8min，调整细胞浓度为5×104/mL加于96孔培养板，每孔100μL，再分别加入不同浓度药物（1.5、1.8、2.2、2.5、2.8、3.2mg/mL），并设置培养液对照。置37℃，体积分数为5％CO2条件下培养56～72h，于结束前4h加入MTT10μL/孔，4h后弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100μL/孔，振荡10min左右，置酶标仪测A值，波长为570nm。用含15％小牛血清的1640培养液将801-D细胞或肿瘤细胞接种于96孔板，每孔100?μl，设空白组及不同肿瘤细胞浓度组，每组分别设为5×102、1×103、5×103、1×104、2×104、5×104／孔。置37℃、5％CO2饱和湿度培养72小时，弃上清。每孔加MTT20?μl(浓度5?mg／ml)，继续培养4小时。加100?μlDMSO，平板振荡器上震荡5分钟，在酶标仪上以570?nm波长检测。脾T淋巴细胞增殖反应测定[4]脾细胞（2.5×105/孔）在37℃，5%CO2培养条件下，用10ug/mlgD蛋白（阴性对照组为RPMI1640培养基；阳性对照组为5ug/mlPHA）刺激3天。加入10ulMTT(5mg/ml)，37℃继续培养4小时后，每孔加入100ulDMSO溶解formazon。检测各孔490nm光吸收值（每一组设3个重复孔）；计算刺激指数（SI）=A490nm(实验组)/A490nm(阴性对照组)。3.1.1MTT法3.1.1.1原理当T淋巴细胞受ConA、PHA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解将MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色的甲(formaZan)结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。3.1.1.2丁器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2－基乙醇(2－ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐、异丙醇、MTT、Hanks液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)200目筛网、24孔培养板，96孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、联免疫检测丁、超净工作台3.1.1.3实验步骤完全培养液RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨胺(200mmol/L)，青霉素(100U/mL)，链霉素(100ug/L)及5×10－5mol/L的2－基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0－7.2，即完全培养液。ConA液用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(－20℃)保存。无菌Hanks液用前以3.5％的无菌NaHCO3调pH7.2－7.4。MTT液将5mgMTT溶于1mLpH7.2的PBS中，现配现用。性异丙醇溶液96mL异丙醇中加入4mL1mo1/L的HC1，临用前配制。3.1.1.3.2脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为2×106个/mL。3.1.1.3.3淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加50ulConA液(相当5ug/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50u1/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3￣6孔作为平行样，用联免疫检测丁，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入1mL比色杯中，在721分光光度计上比色测定，波长570nm。3.1.1.4数据处理及结果判定一般采用方差分析进行数据统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值，即可判定该项试验结果阳性。小鼠18只,随机分为三组,连续给药7天,于末次给药次日脱颈处死小鼠,无菌取了脾脏,在HANKS液中,用100目钢网和注射器芯研磨,经尼龙布过滤使之成为单个脾细胞悬液,计数后,用含灭活小牛血清的1640培养液配成2.5×10ml,加入96孔平底培养板中,每孔加20μlConA或LPS，ConA终浓度为5μg/ml，LPS终浓度为10μg/ml，每组三个复孔，并设相应对照孔，37°C，5%CO2100%湿度下培养72小时后，每孔加入5mg/ml的MTT10μl,37°C孵育4小时,取出后,离心去上清,每孔加入200μl酸化异丙醇,静置15分钟,待细胞代谢MTT形成的MTT甲充分溶解,用酶标仪测0D值,测定波长570nm.1.3检测指标及方法1.3.1淋巴细胞增殖反应［3］：无菌制备小鼠脾细胞悬液，用RPMI-1640不完全营养液洗涤2次，1000r/min离心10min，然后用完全营养液配成5×106/ml，取100μl加入96孔细胞培养板内(每孔含5×105/ml个细胞)，加入终浓度为5μg/ml的ConA,37℃，5%CO2培养箱中培养48h后，每孔加入10μlMTT溶液(5mg/ml)，再继续培养至12h，然后加入DMSO100μl，充分振荡后静止20min，用检测波长560nm全自动酶标仪进行比色分析。1.3.2IL-2的诱生：取上述已制备的脾细胞悬液5×106/ml，放培养瓶中37℃，5%CO2培养箱中培养40h，离心收集上清液，-20℃冰箱保存备用。1.3.3制备活化的脾淋巴细胞［5］：按上法取正常Balb/C小鼠无菌取脾脏，制成5×106/ml细胞悬液，加入ConA使其终浓度为5μg/ml，置37℃，5%CO2培养箱中培养48h，收集细胞，离心洗2次，用完全RPMI-1640配成5×105/ml细胞悬液，作为测IL-2的反应细胞。1.3.4IL-2活性检测：取-20℃保存的IL-2上清，并做1/2和1/4的稀释，在96孔平底培养板中，每孔加入IL-2上清原液或不同稀释度的IL-2上清100μl，以及上述反应细胞100μl；阴性对照不加IL-2上清，加100μl1640培养液，各没4复孔。于37℃，5%CO2培养箱培养48h，每孔加MTT(5mg/ml)10μl，继续培养4h，吸弃100μl上清，加入酸化异丙醇100μl(0.04mol/L、HCl-异丙醇)，充分振荡后静止20min，用检测波长560nmHCl全自动酶标仪进行比色分析。1.4结果处理：实验结果采用组间均数差异性t检验的方法进行统计分析。第四节细胞计数及活力测定一、原理培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。二、仪器、用品与试剂1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇3、材料：细胞悬液三、操作步骤（一）细胞计数1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。（二）细胞活力1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。（三）MTT法测细胞相对数和相对活力活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。2、沉淀加入0.5－1mlMTT，吹打成悬液。3、37℃下保温2小时。4、加入4—5ml酸化异丙醇（定容）。打匀。5、1000rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。第五节细胞的分裂指数一、原理:体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。二、仪器、用品与试剂1、仪器与用品：CO2培养箱、普通显微镜、细胞培养血、盖玻片、吸管2、试剂：培养液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液三、操作步骤1、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。2、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。3、取出盖片，按下列顺序操作：PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。4、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。5、计算:分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%四、注意事项;操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。第六节细胞周期的测定一、原理:细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。二、仪器、用品与试剂1、仪器、用品：同常规细胞培养2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液三、操作步骤1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。6、弃去2×SSC液，流水冲洗。7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。8