微生物试验 抑菌效果预测

第五小组：兰玉蓓张冬吴立音富爽爽前言抗病原体药物抗生素消毒剂防腐剂（1）作用机理的选择性抑制细胞壁合成、干扰细胞膜、抑制蛋白质合成、抑制核酸合成抗菌效果：抑菌、杀菌和溶菌（2）对微生物有选择性：青霉素对多种革兰氏阳性细菌都有良好药效，链霉素对多种革兰氏阳性和阴性细菌都有良好药效，对结核杆菌有特殊的疗效；氯霉素、四环素、金霉素、土霉素对G-和G+、立克次氏体、衣原体均有作用，属于广谱型抗生素；放线菌酮、两性霉素B、灰黄霉素对真菌有抑制作用。（3）一般都在很低浓度下对病原菌就发生作用有效浓度：抑制微生物生长的最低浓度。低强度抗生素：有效浓度≥100mg/L高强度抗生素：有效浓度≤1mg/L在这么多抗病原体药物中，到底哪种药物的抗菌效果最好呢？本次实验，我们选取了氨苄青霉素、链霉素、红药水、丙酸，分别对大肠杆菌（G-）、枯草芽孢杆菌（G+）作用，比较它们的抗菌效果氨苄青霉素是杀菌性的抗生素。能渗透革兰氏阳性菌及部份革兰氏阴性菌。经由结合在细菌细胞壁上的青霉素结合蛋白（penicillin-bindingproteins，PBPs），阻碍细菌合成细胞壁的第三及最后阶段，最终引致细胞裂解。链霉素主要与原核细胞(如细菌)核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质(酶)的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡。红药水红药水的有效成分是汞溴红，其中的阳离子汞能与细菌蛋白质结合，影响细菌的代谢过程，从而达到抑制细菌生长的目的。丙酸的防霉机理目前公认的有两个1、非解离的丙酸活性分子在霉菌细胞外形成高渗透压是霉菌细胞内脱水而失去繁殖能力2、丙酸活性分子可穿透霉菌细胞壁，抑制细胞内的酶活性而阻止霉菌的繁殖本实验通过自主设计，研究一些常用抗生素、消毒剂的抑杀菌效果掌握检测化学抑杀菌剂作用效果的方法了解一些常用化学抑杀菌剂的作用机理以及效果差异。通过实验操作，进一步巩固已学习的微生物实验技能，学以致用。待测菌种：大肠杆菌（G-），枯草芽孢杆菌（G+）药剂：抗生素类药物——氨苄青霉素、链霉素(50μg/μL)消毒剂和防腐剂——红药水、丙酸材料：LB培养基，移液枪100uL，培养皿20个，小试管32支(20mL)，移液枪（蓝、黄枪头各一盒），滤纸片100个，生理盐水，高压蒸汽灭菌锅，150ml锥形瓶4个，500ml锥形瓶2个，酒精灯，接种环。1、配制培养基：LB固体培养基：蛋白胨10g/L(1g/100mL)牛肉膏5g/L(0.5g/100mL)琼脂6g/L(0.6g/100mL)NaCl10g/L(1g/100mL)调pH7.0~7.2与生理盐水、移液枪置于高压蒸汽，灭菌。2、稀释：（如下表）氨苄青霉素：浓度5ug/mL10ug/mL50ug/mL250ug/mL1250ug/mL水2mL1mL199uL156uL105uL氨苄青霉素1uL1uL1uL4uL15uL•链霉素：浓度5%10%50%80%100%水152uL180uL75uL120uL0uL红药水8uL70uL75uL30uL150uL浓度0.08%0.4%2%10%50%水1249uL249uL147uL180uL75uL丙酸1uL1uL3uL20uL75uL浓度4ug/mL20ug/mL100ug/mL500ug/mL2500ug/mL水2mL1mL180uL190uL150uL链霉素1uL1uL2uL10uL40uL红药水：丙酸：3、混菌：（45℃时）将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌接种至培养基并注入培养皿，混匀，自然冷却至凝固。平板个数：20mL/皿*20个4、点样：用移液枪分别移取30uL所选试剂，如下图点样，第一个皿点四种药物的最低浓度，其余四个皿依次按浓度梯度点样，中心滤纸点生理盐水，为空白对照，并重复一皿。（2菌种*2.5皿/1菌*4药品）药1对照药4药3药25、培养：37℃下培养20h，观察。测抑菌圈直径，做直径-药剂浓度对数曲线。6、配置菌悬液：分别取一定量大肠杆菌、枯草芽孢杆菌制作菌悬液。7、配制培养基：LB液体培养基：蛋白胨10g/L(4g/400mL)牛肉膏5g/L(2g/400mL)NaCl10g/L(4g/400mL)调pH7.0~7.2高压蒸汽灭菌。1.比浊法：选取上述实验所得抑菌效果较好的药品、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的菌悬液、LB液体培养基如下表装入30支试管中：按上述方法平行配制3组，其中一组未加药品，用生理盐水补充容积，共30支。红药水浓度70ug/mL120ug/mL170ug/mL220ug/mL270ug/mL加入药品量uL3uL6uL8uL11uL13uL加菌悬液uL987uL987uL987uL987uL987uL加生理盐水uL10uL7uL5uL2uL0uL9、培养：将1组、2组（未加药品）置于37℃下培养12h，3组置于0℃冰箱中培养12h。10、测量及处理：在600nm下测量各试管吸光度，做OD值—药剂浓度对数曲线。1、滤纸法测抑菌效果实验分析：氨苄青霉素浓度梯度配置2ug/mL10ug/mL50ug/mL250ug/mL1250ug/mL加入药品量uL1uL1uL1uL4uL15uL加入蒸馏水量uL2mL1mL199uL156uL105uL氨苄青霉素（1×104ug/mL）对细菌的直径-药剂浓度对数曲线数值药物浓度药剂对数浓度大肠杆菌抑菌圈平均直径/mm枯草芽孢杆菌抑菌圈平均直径/mm5ug/mL0.717.5010ug/mL118050ug/mL1.720.50250ug/mL2.423.501250ug/mL3.1270从氨苄青霉素对细菌的直径-药剂浓度对数曲线中可以看出：•1、氨苄青霉素对大肠杆菌有抑制作用，但即使其浓度达到1250ug/mL时，抑菌效果相对其他药品仍要弱，经查阅文献，氨苄青霉素的最低抑菌浓度为64ug/mL，由此可见其抑菌效果并不十分显著；•2、氨苄青霉素对枯草芽孢杆菌无抑制作用，未出现抑菌圈；•3、氨苄青霉素对革兰氏阳性细菌无抑制作用，对阴性细菌有抑制作用；•4、在比浊法选用药品时，可将氨苄青霉素排除。链霉素浓度梯度配置5ug/mL10ug/mL100ug/mL500ug/mL2500ug/mL加入药品量uL1uL1uL2uL10uL40uL加入蒸馏水量uL2mL1mL180uL190uL160uL链霉素（1×104ug/mL）对细菌的直径-药剂浓度对数曲线数值药物浓度药剂对数浓度大肠杆菌抑菌圈平均直径/mm枯草芽孢杆菌抑菌圈平均直径/mm5ug/mL0.719.517.510ug/mL120.519100ug/mL22326500ug/mL2.723.5282500ug/mL3.42633.5由链霉素对细菌的直径-药剂浓度对数曲线可以看出：1、链霉素对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用；2、相同浓度的链霉素对枯草芽孢杆菌的抑制作用大于对大肠杆菌的抑制作用；3、链霉素对大肠杆菌的抑制作用随着药剂浓度的增加而缓慢增加。在浓度为100ug/mL至500ug/mL时，出现为平稳期，但过短。而后随着药剂浓度的增加，抑制作用又加强。4、链霉素对枯草芽孢杆菌的抑制作用随着药剂浓度的增加而缓慢增加。在浓度为100ug/mL至500ug/mL时，出现为平稳期，但过短。而后随着药剂浓度的增加，抑制作用又加强。5、链霉素对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制曲线未出现平稳期或平稳期过短，故不选用该药物进行下一步实验。红药水浓度梯度配置5%10%50%80%100%加入药品量uL8uL70uL75uL30uL150uL加入蒸馏水量uL152uL180uL75uL120uL0uL红药水（2×104ug/mL）对细菌的直径-药剂浓度对数曲线数值药剂浓度药剂对数浓度大肠杆菌抑菌圈平均直径/mm枯草芽孢杆菌抑菌圈平均直径/mm5%3192110%3.325.529.550%42630.580%4.225.523.5100%4.329.531.51、红药水对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有明显的杀菌作用；2、相同浓度的红药水对枯草芽孢杆菌的杀菌作用明显大于对大肠杆菌的杀菌作用；3、红药水对大肠杆菌的抑制作用随着药剂浓度的增加而明显增加。在红药水浓度达到10%至80%时，抑制效果达到平稳，在药剂浓度达到100%时的抑制作用大大加强，呈直线上升。4、红药水对枯草芽孢杆菌的杀菌作用随着药剂浓度的增加而明显增加。在药剂浓度达到对枯草芽孢杆菌的抑菌作用在10%至50%时，抑制效果达到平稳期，50%至80%抑菌作用明显减弱，呈直线下降，可能是由于枯草芽孢杆菌对80%的红药水出现耐受性所致。药剂浓度进一步加大，达到100%×(2×104ug/mL)时的抑制作用又大大加强，呈直线上升，此时的枯草芽孢杆菌对红药水的耐受性已被药物的高浓度掩蔽。5、由实验结果可见，实验前期经讨论所选择的5个红药水浓度梯度较合适，得出的曲线出现同样抑菌圈时的最小药物浓度。2、比浊法测抑菌效果实验分析丙酸浓度梯度配置0.08%0.4%2%10%50%加入药品量uL1uL1uL3uL20uL75uL加入蒸馏水量uL1249uL249uL147uL180uL75uL丙酸（分析纯100%）对细菌的直径-药剂浓度对数曲线数值药剂浓度药剂对数浓度大肠杆菌抑菌圈平均直径/mm枯草芽孢杆菌抑菌圈平均直径/mm0.08%1.918.519.50.4%2.622.524.52%3.3252810%4283450%4.744.548.5分析结果从丙酸对细菌的直径-药剂浓度对数曲线中可以看出：1、丙酸对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有明显的杀菌作用，50%的丙酸甚至出现了49mm的抑菌圈；2、相同浓度的丙酸对枯草芽孢杆菌的杀菌作用大于对大肠杆菌的杀菌作用；3、丙酸对大肠杆菌的杀菌作用随着药剂浓度的增加而缓慢增加。在浓度为2%至10%时丙酸对大肠杆菌的杀菌作用为平稳期。而后随着药剂浓度的增加，杀菌作用又加强。4、丙酸对枯草芽孢杆菌的抑制作用随着药剂浓度的增加而缓慢增加。5、丙酸的杀菌作用虽然在50%出现了49mm的抑菌圈，但在所选浓度范围内未出现平稳期或平稳期过窄，因此不选用此药物进行下一步实验。•大肠杆菌OD值-红药水浓度对数曲线红药水浓度ug/mL红药水浓度对数0℃加药37℃加药37℃不加药70ug/mL1.90.860.9070.246120ug/mL2.10.860.9170.252170ug/mL2.20.8730.910.247220ug/mL2.30.871.1490.237270ug/mL2.40.880.9510.228•枯草芽孢杆菌OD值-红药水浓度对数曲线红药水浓度ug/mL红药水浓度对数0℃加药37℃加药37℃不加药70ug/mL1.90.7240.7960.066120ug/mL2.10.7350.8010.08170ug/mL2.20.740.8150.054220ug/mL2.30.761.0120.09270ug/mL2.40.7930.9210.056从大肠杆菌OD值-红药水浓度对数曲线、枯草芽孢杆菌OD值-红药水浓度对数曲线中可以看出：•OD=log（1/A）（备注：A为吸光度数值）由于A的数值与菌种的混浊度相关。菌种的混浊度与药品对菌种的杀菌程度相关；药品杀菌程度越小，混浊度越大，A值越大，相应地OD值越小。药品杀菌程度越大，反之。•在0℃和37℃下加入相同剂量的红药水，在0℃加药情况下，曲线相对平稳，OD值无明显变化，在37℃加药情况下，曲线有明显变化；（1）、在低温下，药剂浓度的改变对菌种的抑制作用不明显，（2）、低温对菌种的生长抑制作用相对药品对菌种的生长抑制作用占优势；•4、在37℃下，分别加入红药水和等量的生理盐水，加药的OD值比不加药的OD值大，说明红药水对菌种的生长抑制作用明显；在相同温度，浓度为220ug/mL时OD值最大，说明在37℃此浓度下，红药水的杀菌作用最强。•5、在37℃加药情况下，经红药水处理的大肠杆菌OD值在0.9——1.2；经红药水处理的枯草芽孢杆菌的OD值在0.8——1.0；说明红药水对枯草芽孢杆菌的抑制作用强于对大肠杆菌的抑制作用。与药物筛