OKY-046安全性研究第1报

OKY-046·HCl的毒理学研究（第1报）——大鼠、小鼠、狗以及幼年小鼠、幼年大鼠的急性毒性试验——桔生藥品工業株式会社中央研究所伊坂哲男柴田信男百瀨泰紀伊佐治正幸清澤岩水矢口友則内藤惇小野藥品工業株式会社福井安全性研究所洒井芳紀松岡康夫日本実騴医学研究所平井出良彦概要对小鼠及大鼠在经口给药、静脉给药、皮下给药时讨论了OKY-046·HCl的急性毒性，并同时对幼年小鼠、幼年大鼠及犬在经口给药情况下的急性毒性进行了研究。1）在一般症状观察中，各给药途径中小鼠及大鼠均出现镇静、自发性运动减少、呼吸变深、呼吸困难、阵挛性惊厥及强直性抽搐等现象，在犬则观察到呕吐、腹泻等症状。2）死亡动物几乎在24小时内发生死亡，死因认为是循环障碍及呼吸功能不全所致。3）存活动物恢复性良好，故认为无延迟性毒性4）在剖检及病理组织学检查中，试验中死亡动物有肺、肝脏、肾脏瘀血及胃、小肠粘膜出血等现象；存活动物经非经口给药时，观察到给药部位有硬结、脱毛、坏死等现象。5）在经口给药中，LD50小鼠雄性为4,074.0mg/kg，雌性为3,843.9mg/kg；幼年小鼠雄性为4,191.4mg/kg，雌性为3,196.4mg/kg；大鼠雄性为6,840mg/kg，雌性为6,620mg/kg；幼年大鼠雄性为4,164.4mg/kg，雌性为4,261.7mg/kg；狗在5000mg/kg以上，且无性别差异。此外对幼年动物的毒性不是特别强。前言OKY-046是特异性血栓素A2（thromboxaneA2）合成酶抑制剂1-3），其钠盐作为注射剂在临床上用于蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛及作为脑血管改善药来使用。而针对其对呼吸道过敏症的抑制作用4、5）而开发的OKY-046盐酸盐（以下简称为OKY-046·HCl），作为口服剂型，有希望作为支气管哮喘治疗药物来开发。本试验作为对OKY-046·HCl安全性评价的一个环节，对小鼠、大鼠及狗的急性毒性进行了研究。进而通过对幼年小鼠及幼年大鼠急性毒性的评价，研究其对儿童用药的情况，具体报道如下。试验材料及试验方法：1、受试药物OKY-046·HCl化学名反式-3-[p-（1H-咪唑基-1甲基）-苯基]-2-丙烯酸盐酸一水合物。分子量为282.73。为白色结晶性粉末，易溶于甲醇，微易溶于水，微难溶于乙醇，几乎不溶于丙酮及乙醚。其结构式如图1所示。图1、化学结构式，反式-3-[p-（1H-咪唑基-1甲基）-苯基]-2-丙烯酸盐酸一水合物（OKY-046）。2、使用动物及饲养环境1）试验小鼠使用ICR系雌雄小鼠进行试验。经口及静脉给药试验用小鼠由静冈县实验动物农业协作组购入；皮下给药试验用小鼠由日本チヤ一ルス·リバ一株式会社购入。各动物均为4.5～5周龄左右。使用预备饲养中健康发育6周大小鼠用于试验。试验初始体重，经口给药试验组，雄性31.5～36.0g，雌性23.2～27.5g；静脉给药试验组，雄性28.5～35.5g，雌性24.0～28.3g；皮下给药试验组雄性27.1～33.3g，雌性21.2～25.4g。各试验动物饲养室环境均为，温度为22～23℃，湿度为48～62%，照明时间为12小时。试验动物在金属制网状5链及10链笼中分别饲养。幼年小鼠使用由日本クレア株式会社购入的妊娠第11日母鼠所生的3周大幼鼠。其体重范围为雄雌均为50～200g，在温度为21～25℃、湿度为45～65%、照明时间为12小时的饲养室内，置于塑料笼中分别饲养。2）试验大鼠试验用SD系雌雄大鼠，经口及皮下给药试验用大鼠由日本チヤ一ルス·リバ一株式会社购入；静脉给药试验用大鼠由静冈县实验动物农业协作组购入。试验使用在1～2周预备饲养期间的健康成长大鼠，经口及静脉给药试验组使用6周龄大鼠；皮下给药试验组使用7周龄大鼠。试验初始体重，经口给药试验组，雄性120～140g，雌性110～130g；静脉给药试验组，雄性156.8～207.0g，雌性117.8～146.7g，皮下给药试验组，雄性199～238g，雌性158～190g。各饲养室环境均为温度20～25℃，湿度50～64%，照明时间为12小时。经口给药试验组，每个金属笼中饲养2只试验大鼠，其它试验大鼠分笼饲养。试验用幼年大鼠使用由日本クレア株式会社购入的妊娠14日母鼠所生的3周龄大鼠。试验初始体重为，雄性31.0～40.3g，雌性27.0～38.1g，分别饲养于湿度为45～65%，温度为21～25℃，照明时间为12小时的金属笼中。以上所有试验用大鼠及试验用小鼠，均可自由摄取水份及固型饲料（CE-2，日本クレア株式会社制）。3)试验犬由LaboratoryResearchEnterprises公司购入6～8月龄大雄性猎兔犬，2周检疫期结束后，根据检疫结果及临床检查结果选用其中9头用于试验。试验初期体重为8.3～11.5kg，在温度为18～28℃，湿度为30～70%，照明时间为8小时的饲养室内，单笼分别饲养，每日限制给食固性饲料（CD-5，日本クレア株式会社制）300g；水，可自由摄取。3、给药方法小动物经口及皮下给药试验，受试药物以0.5%CMC水溶液混合，悬浊。经口给药采用金属制灌胃器强制给药，皮下给药于颈背部皮下给药。在给药时，除大鼠经口给药在非禁食条件下进行外，其余经口给药动物一律在禁食一夜条件下进行。静脉给药试验，受试药物用注射用蒸馏水溶解后，滤过灭菌，以2ml/min的注射速度尾静脉给药。在对犬的试验中，将受试药物填充至明胶胶囊（1/2盎司，ChemicalandPh-armaceuticalIndustryCo.,Inc.制）中，经口给药。各动物在各给药途径中给药剂量、给药容量及受试药物浓度如表1～3所示。表1、OKY-046对小鼠的急性毒性表2、OKY-046对大鼠的急性毒性给药途径给药剂量ml/kg给药容量或给药浓度致死量LD50（mg/kg）给药途径给药剂量ml/kg给药容量或给药浓度致死量LD50（mg/kg）雌鼠雄鼠雌鼠雄鼠雌鼠雄鼠雌鼠雄鼠口服给药3,01030ml/kg0/71/74,074.0a)（3,714.2～4,495.8）3,843.9a）（3,306.7～4,348.2）口服给药4,20020%0/100/106,840b)（5,950～7,870）6,620b)（5,760～7,610）3,3701/72/75,0000/102/103,7703/73/76,0002/103/104,2204/76/77,2005/107/104,9306/75/78,6009/1010/105,3006/76/710,30010/1010/10静注给药35010%0/70/7503.0a)（458.7～562.2）551.5a)（504.1～653.2）静脉给药56010%0/70/7713.5a)（650.1～782.8）727.1a)（672.8～788.7）4001/70/76302/72/74602/71/77102/72/75303/73/78005/75/76107/75/79007/77/7皮下给药1,51220ml/kg0/100/101,929a)（1,810～2,058）1,980a)（1,851～2,116）皮下给药1,51220mg/kg0/100/102,049a)（1,850～2,251）2,314a)（2,114～2,588）1,7391/101/101,7391/101/102,0008/107/102,0004/104/102,3009/108/102,3004/104/102,64510/1010/102,6458/108/103,04210/1010/103,0428/108/103周龄口服给药82420ml/kg0/80/84,191.4a)（2,848.9～6,166.8）3,196.4b)（2,262.3～4,516.1）3周龄口服给药3,49820ml/kg10/1010/104,164.4b)（3,491.6～4,966.7）4,261.7b)（3,485.8～5,210.2）1,1760/100/101,8350/100/101,6810/100/92,2940/100/102,4012/104/102,8671/100/103,4306/104/103,5845/103/104,9006/108/104,4805/106/107,0006/109/95,6008/109/910,00010/108/97,00010/108/9表3、OKY-046·HCl对雄犬的急性毒性给药途径给药剂量（mg/kg）致死量LD50（mg/kg）口服给药1.0000/3＞5,0003,0000/35,0000/34、观察、各项检查及LD50值的计算1）观察及体重测定在大鼠经口给药中，观察时间为7天，在此7天内，不测定体重；幼鼠及其它试验进行14天观察，在此期间内，需测定体重6次以上。2）剖检及脏器重量测定各试验均需对所有的中途死亡例及存活例进行剖检，在犬，对心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏的重量进行测定。3）病理组织学检查除幼年小鼠外的小鼠试验3，大鼠静脉内给药，皮下给药试验2，以及犬试验中均进行病理组织学检查，也就是说，在小鼠、大鼠试验中对一部分动物，犬对全体动物，检查主要脏器以及肉眼判定异常的脏器和组织的异常。4）犬的各项检查在给药前及给药后数次，进行尿检查、粪便潜血检查、血液学检查及血液生化学检查。尿检查，采集自然排泄的尿液后，迅速用多用途试药试纸（マィルス—三共）进行半定量分析。粪便潜血检测，用愈创木试验方法。血液学常规检查，测定红细胞数（RBC）、血红蛋白量（Hb）、红细胞比溶值（Ht）、白细胞数（WBC）（以上用微细胞计算器CC-120型，东亚医用电子株式会社制）、血小板数（Plt）（使用微细胞计算器PL-100型，东亚医用电子株式会社制）。血液生化学检查，使用自动测定器（日立705型）检查以下项目，GOT、GPT、ALP、总蛋白量、总胆固醇量、血糖、CPK、尿素氮。5）LD50值的计算对幼年小鼠、幼年大鼠及大鼠经口给药试验中，用Litchfield-Wilcoxon法6）计算LD50值，其他小鼠及大鼠试验用Probit法计算LD50值。在犬试验中，如下文所述，即使用最大可能给药剂量给药也未见死亡动物出现，故未能求出LD50值。试验结果1、小鼠试验各给药途径中死亡率及LD50值（95%可信限）一并概括如表1所示。1）经口给药LD50值（95%可信限）雄性为4,074.0mg/kg（3,714.2～4,495.8mg/lg），雌性为3,843.9mg/kg（3,306.7～4,348.2mg/kg），未见性别差异。在给药后10分钟开始发现有自发性运动减少、伏卧、呼吸短促等现象，进而一部分动物出现反应迟钝、体温降低、呼吸短促等现象。在死亡例中发现有呼吸变浅、呼吸困难、云翳、眼球湿润、眼球冲血、耳介苍白、震颤、步行异常、蹲坐姿态以及横卧等现象。给药后1小时到32小时出现死亡。在存活例中几乎所有症状在给药次日消失。而在以后的时间中，除雄性动物的中、高剂量给药组体重增加略有降低外，其它各组动物的体重增加均正常。剖检，在死亡例中观察到胃及空肠粘膜出血，高剂量组中有肺部瘀血及肝脏黄色调化现象，在存活例中未发现有特殊异常现象。病理组织学检查中，观察到死亡例肝脏小叶中心～边缘区脂肪样变。2）静脉给药雄性LD50值（95%可信限）为503.0mg/kg（458.7～562.2mg/kg），雌性LD50值（95%可信限）为551.5mg/kg（504.1～653.2mg/kg）。无性别差异。死亡例，给药后立即出现耳廓苍白，呼吸困难及阵挛性惊厥等现象，在给药后约2分钟内死亡。存活例，低剂量组在给药后立刻观察到耳廓苍白、伏卧或横卧、呼吸短促等现象，进而出现步样异常、震颤、呼吸迟缓、呼吸困难及阵挛性惊厥等现象。最高剂量给药组，给药后4小时，其它各组在给药后30min症状开始消失至恢复正常，此后的观察期间内，体重正常增加。剖检，试验中死亡例无值得注意的现象，存活