怀化医专微生物学检验教案

1怀化医专《微生物学检验》教案编号：2010年上学期授课教师桂芳教研室主任审核签名李争鸣教学课题衣原体、支原体、立克次体课时授课时间月日月日月日月日月日月日2星期星期星期星期星期星期授课对象检验专业班级目的要求1、掌握主要致病性衣原体、支原体、立克次体概念、特点及其微生物学检验法。2、了解衣原体的培养特性和防治原则，立克次体流行病学和防治。教学重点及难点重点：1、支原体、支原体、立克次体的概念与特征2、支原体、支原体、立克次体的主要生物学性状3、支原体、支原体、立克次体的微生物学检验难点：支原体、支原体、立克次体的微生物学检验。教法与学法讲授法课型理论课教学手段多媒体教学内容与时间分配衣原体:（1）衣原体概述。（10min）（2）主要病原性衣原体致病性和微生物学检验。（20min）立克次体:（1）立克次体概述。（5min）（2）主要病原性立克次氏的传播方式与致病特点、微生物学检查。（25min）支原体：（1）概述。（5min）（2）主要病原性支原体的致病作用和微生物学检查，其他支原体的致病作用。（25min）总结（10min）复习思考题什么叫支原体、支原体、立克次体？各有哪些特征？参考资料1、张卓然主编《临床微生物学与微生物检验》人卫出版社第3版2006.112、倪语星主编《临床微生物学与检验》人卫出版社第4版，2007年3、李凡主编《医学微生物学》人卫出版社第7版2008.1自评本次课内容较多，概念之间容易混淆，在讲课过程中特别注意进行各类微生物之间的横向比较，做到重点突出，条理清楚。2衣原体、支原体、立克次体第二十六章衣原体及检验第一节概述一、衣原体的概念和特征衣原体（chlamydia）是一类能通过细菌滤器，严格活细胞内寄生，有独特发育周期的原核细胞型微生物。共同特征：①体积大于病毒，约250～500nm，在光学显微镜下可以查见，革兰染色阴性，圆形或椭圆形。②含有DNA和RNA。③具有细胞壁，但无肽聚糖，只含微量的胞壁酸。④对多种抗生素敏感。⑤具有一些酶类但不够完善，这些酶缺乏产生代谢能量的作用，要由宿主细胞提供，故专性细胞内寄生。能在鸡胚卵黄囊及多种细胞中生长繁殖。⑥有独特发育周期，仅在活细胞内以二分裂方式繁殖。分布：广泛寄生于人类、鸟类及哺乳动物。致病种类：沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体二、生物学性状（一）形态：在细胞内生长繁殖，具有独特的发育周期：1.原体：球形，椭圆形，小而致密，0.2-0.4um，光镜下勉强可见；Giemsa染色呈紫色。为成熟的衣原体，具有强的感染性，无繁殖能力。2.始体：由原体侵入细胞，在空泡发育而成。圆形或椭圆形，体大而疏松，0.5-1.0um，光镜可见，Giemsa染色呈红色，为衣原体的繁殖体，无感染性，以二分裂增殖，在空泡内发育成许多子代的原体。成熟的子代原体从破裂的细胞中释放出来，再感染新的易感细胞，开始新的发育周期，每一周期约需48-72小时。33、包涵体：衣原体在易感细胞内增殖所形成的网状体和子代原体的空泡，经染色后可在光镜下看到。称为包涵体。经Giemsa染色后呈紫蓝色。碘染色呈褐色。具有鉴别意义。（二）培养特性：专性活细胞内寄生，多数能在6-8日龄鸡胚卵黄囊中生长繁殖，并可在卵黄囊中找到包涵体和原体。有些可感染小鼠，如鹦鹉热衣原体等。可在某些原代或传代细胞株中生长，如Hele-299等，并比鸡胚更敏感。（三）抵抗力：耐冷怕热，60℃10min可失去感染性，-70℃可保存数年；对消毒剂敏感；对利福平、四环素、红霉素、磺胺药敏感。(四)抗原构造与分型1、属特异性抗原：为细胞壁上的脂多糖，但不同于细菌。2、种特异性抗原：为衣原体的主要外膜蛋白（MOMP）,可以用补体结合、中和实验测出以鉴别不同的衣原体。3、型特性异抗原：也存在于MOMP，为蛋白质，可对衣原体分型。第二节主要致病性衣原体一、沙眼衣原体1956年，由汤飞凡首次用鸡胚培养分离到。分三个亚种：沙眼生物亚种沙眼生物变种有A、B、Ba、C、D、Da、E-I、Ia、J、K等14个血清型；性病淋巴肉芽肿生物亚种有L1、L2、L2a、L3四个血清；鼠生物亚种。（一）生物学性状：可在细胞浆中形成包涵体（由密集的原体和始体组成）包涵体可呈散在型、帽型、桑椹型或填塞型Giemsa染色后呈紫色。（二）致病性所致疾病4（1）沙眼：主要由沙眼生物变种的A、B、Ba、C型引起，通过眼—眼及眼—手—眼传播。沙眼衣原体感染结膜上皮细胞并在其中繁殖，在胞浆中可形成散在型、帽型、桑椹型或填塞型包涵体（彩图19），主要表现为滤泡，乳头增殖，血管翳和瘢痕形成。由于反复发作，使瘢痕加剧，损伤角膜变混浊，最终可失眼。（2）包涵体结膜炎：由沙眼生物变种D-K血清型引起。可经性接触，手—眼或间接接触而感染。新生儿可经产道感染引起化脓性结膜炎（也称包涵体性脓漏眼）。不侵犯角膜。（3）泌尿生殖道感染：经性接触传播，主要由D-K型沙眼生物变种引起，是性病的主要病原。还可引起尿道炎、阴道炎、盆腔炎等。如输卵管炎反复发作，可导致不孕症和宫外孕。（4）性病淋巴芽肿（lymphongranulomavenereum,LGV）：由；L1、L2、L2a、L3四个血清型引起。主要通过性接触传播，是一种性病。外阴部可形成溃疡，还可侵犯腹股沟淋巴结，也可累及会阴、肛门、直肠及盆腔淋巴结，发生化脓性炎症和慢性肉芽肿。二、鹦鹉热衣原体引起呼吸道感染，鹦鹉热原为野生鸟类及家禽的自然感染，也可经呼吸道传给人，发生呼吸道感染和肺炎。三、肺炎衣原体只有一个血清型，1965年从台湾一小学生眼结膜分离出一株称TW-183；1983年又从美国的大学生的急性呼吸道感染者的咽喉部分离出另一株称AR-39,将这两株的字头合并，称作TWAR株。致病性：引起急性呼吸道感染。寄生于人，是人类重要的呼吸道病原体，经呼吸道感染。可引起肺炎、支气管炎、咽炎。世界各地肺炎衣原体感染非常广泛，成人体内的抗体阳性率可达50%，约5-10%的成人肺炎是由肺炎衣原体引起。近年，还发现TWAR株慢性感染与冠状动脉硬化和心脏病的发生有关。三种衣原体主要特性比较。5第三节衣原体的微生物学检验一、标本采集：1、沙眼、包涵体结膜炎：用棉拭在眼穹隆部、眼结膜上涂擦，或用无菌小刀刮取上皮细胞；2、泌尿生殖道感染：取泌尿生殖道拭子、宫颈刮片、或精液等；3、性病淋巴肉芽肿：抽取淋巴结脓肿脓液，采集血清做抗体检测；4、鹦鹉热、和肺炎衣原体感染：可取痰、咽拭子、血清。二、检验程序三、检验方法及鉴定1、直接涂片镜检：沙眼急性期可在结膜病灶作刮片，用Giemsa染色直接镜检或免疫荧光检查，观察上皮细胞浆内有无特殊包涵体，查见有诊断价值。2、分离培养：（1）鸡胚卵黄囊接种法：7日龄鸡胚，标本先用抗生素处理。（2）细胞培养法：经X线照射的McCoy细胞和Hela-299细胞。（3）小鼠接种：用于鹦鹉热衣原体的分离，可用：腹腔、脑内、鼻腔接种。3、免疫学诊断：查抗原和抗体，目前均有相应试剂盒供应。(1)抗体检测：补体结合试验、微量免疫荧光法等(2)抗原检测：免疫荧光染色、金标法、酶标法等(3)核酸探针或PCR技术作用核酸检测，其敏感性、特异性更优。第二十七章立克次体及检验概念：立克次体（Rickettsia）是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，在形态结构、化学组成及代谢方式等方面均与细菌类似：具有细胞壁；以二分裂方式繁殖；含有RNA和DNA两种核酸；由于酶系不完整需在活细胞内寄生；对多种抗生素敏感等。共同特点：①大多是人畜共患病原体，引起人类发热和出疹性疾病；②以节肢动物为传播媒介或为储存宿主；③大小介于细菌与病毒之间，光镜下呈多形态性，主要为微，杆状或球6杆状，革兰阴性；④除了少数外全是专性活细胞内寄生；⑤菌体内同时含有DNA和RNA两类核酸；⑥以二分裂方式进行繁殖；⑦对抗生素敏感。对人类致病的立克次体科包括立克次体属、柯克斯体属和罗沙利马体属等三个属。立克次体属又分成三个生物群：斑疹伤寒群、斑点热群与恙虫病群。第一节概述一、生物学性状（一）形态染色与结构1、形态：多形态，球杆状或杆状，0.3～0.6×0.8～2.0um。在感染细胞内，常聚集成致密团块状，也可成单或成双排列。不同立克次体在细胞内的分布不同，可供初步识别。如普氏立克次体常散在于胞质中，恙虫病立克次体在胞质近核旁，而斑点热群立克次体则在胞质和核内均可发现。革兰氏染色阴性，但一般着色不明显，因此常用Giemnez、Giemsa或Macchiavello法染色，其中以Gimenez法最好。该法着染后，除恙虫病立克次体呈暗红色外，其他立克次体均呈鲜红色。Giemsa法和Macchiavello法分别将立克次体染成紫或蓝色和红色。2、结构：与革兰氏阴性杆菌非常相似。用电子显微镜观察：最外层为由多糖组成的粘液层，有粘附宿主细胞及抗吞噬作用。其内为微荚膜或称外包膜，由多糖或脂多糖组成。细胞壁包括外膜（磷脂双分子层）、肽聚糖及蛋白脂类三层。有与细菌内毒素性质相似的脂多糖复合物，但脂类含量比一般细菌高得多。胞浆膜为双层类脂，主要由磷脂组成。胞质内有核糖体（由30s和50s两个亚基组成）。（二）培养特性常用的培养方法有1、动物接种：多种病原性立克次体能在豚鼠、小鼠等动物体内有不同程度的繁殖。在豚鼠睾丸内保存的立克次能保持致病力和抗原性不变。2、鸡胚接种：立克次体还能在鸡胚卵黄囊中繁殖，常用作制备抗原或疫苗的7材料。3、细胞培养：常用的细胞培养系统有敏感动物的骨髓细胞、血液单核细胞和中性粒细胞等，一般不产生细胞病变。以32～35℃孵育最为适宜。（三）抗原结构立克次体有两种主要抗原：一种为可溶性（醚类）抗原，耐热，与细胞壁表面的粘液层有关，为群特异性抗原。另一种为颗粒（外膜）性抗原，不耐热，与细胞壁成份有关，为种特异性抗原。在斑疹伤寒群，群特异性抗原在普氏、莫氏及加拿大立克次体中均存在，与其他属的立克次体很少交叉或不交叉，而种特异性蛋白抗原在上述三个种间互不交叉。恙虫病群中只有恙虫病立克次体一个种，根据恙虫病立克次体种特异性抗原性的差异，可分为若干血清型。立克次体具有与变形杆菌某些X株的菌体抗原（O）共同的耐热多糖类抗原，临床上常用以代替相应的立克次体抗原进行非特异性凝集反应，作为人或动物血清中相关抗体的检查。这种交叉凝集试验称为外斐反应（Weii-Felixreaction），作为辅助诊断。(四)抵抗力除贝钠(Q热)柯克斯体外,立克次体抵抗力较弱。56℃30分钟死亡；室温放置数小时即可丧失活力。对低温及干燥的抵抗力强，在干燥虱粪中能存活数月。对一般消毒剂敏感，对四环素和氯霉素敏感。磺胺类药物不仅不能抑制反而促进立克次体的生长、繁殖。二、致病性与免疫性1、致病物质有两种，一种为内毒素，由脂多糖组成；另一种为磷脂酶A，可分解脂膜而溶解细胞，导致宿主细胞中毒。2、传播媒介是节肢动物，如虱、蚤、蜱、螨等。虱、蚤的传播方式是含大量病原体的粪便在叮咬处经搔抓皮损处侵入人体；蜱、螨传播则是由叮咬处直接注入体内。3、致病性8进入人体后，立克次体首先侵入局部淋巴组织或小血管内皮细胞内，即经过吸附细胞膜上受体而被吞入胞内，再由磷脂酶A溶解吞噬体膜的甘油酸而进入胞质，随后分裂繁殖，导致细胞肿胀、中毒，出现血管炎症，管腔堵塞而形成血栓、组织坏死。立克次体也能进入血流而扩散，到达皮肤、肝、脾、肾等处而出现毒血症症状。立克次体还能直接破坏血管内皮细胞，使透性增加、血容量下降和水肿。另外，血管活性物质的激活可加剧血管扩张，导致血压降低，休克、DIC等。4、免疫性立克次体是严格细胞内寄生的病原体，其抗感染免疫是以细胞免疫为主，体液免疫为辅。病后一般能获得较强的免疫性。感染后产生的特异性群和种抗体有中和毒性物质和促进吞噬的作用。特异性细胞因子有增强巨噬细胞杀灭胞内立克次体的作用。第二节主要病原性立克次体一、斑疹伤寒立克次体（一）普氏立克次体是流行性斑疹伤寒(又称虱传斑疹伤寒)的病原体。病人是惟一的传染源，体虱是主要传播媒介，而非储存宿主。传播方式为虱-人-虱，体虱仅是传染媒介。（二）莫氏立克次体地方性斑疹伤寒(又称鼠型斑疹伤寒)