PRL-3与结直肠癌的研究进展

结直肠癌相关的PRL-3生物信号通路研究摘要促肝细胞再生磷酸酶-3(Phosphataseofregeneratingliver3,PRL-3)是现已发现与结直肠癌转移相关的少数特异性表达分子之一，属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族(proteintyrosinephosphatase，PTP)成员。在应用基因表达系列分析(SAGE)技术分析结直肠癌肝转移基因表达谱时发现，PRL-3基因在大多数结直肠癌的转移标本中的转录水平均明显增加，而该基因在正常结直肠上皮或者非转移性原发结直肠癌中极少表达或不表达。本文从PRL-3与晚期结直肠癌发生发展的关系出发，对PRL-3在结直肠癌转移中的作用及其机制的研究现状进行综述，并对其作为肿瘤治疗和药物作用靶点的可能性进行展望。关键词肝细胞再生磷酸酶-3；癌症转移；结直肠癌结直肠癌(colorectalcarcinoma，CR)是一种常见、严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤。结直肠癌的致病原因尚不明确，主要有饮食因素，并与癌前疾病及其他疾病有明显的关系。研究表明，亚洲许多国家在近十几年里，结直肠癌的发病率增加了2到4倍，己呈明显上升的趋势[1,2]。结直肠癌死亡率高，主要与其转移有关，临床上有一半以上的结直肠癌患者在行根治性手术前已出现了微转移，它是结直肠癌术后转移和复发的直接原因。目前，尚未发现一个单独的、负责肿瘤转移的基因。有些基因，如上皮钙粘素(E-eadherin)和组织金属蛋白酶抑制物(TIMPs)基因，其产物有抑制肿瘤转移的作用，可视为转移抑制基因。粘附分子CD44可能与血性播散有关。在结肠癌，变异型CD44(如V6)高表达提示高转移潜能。在结直肠癌转移过程中的不同阶段存在多种基因/蛋白质的改变，它们与细胞的功能调节有关。这些分子大多同时也参与正常细胞功能的调节。在结直肠癌转移过程中特异性表达的基因则数目很少。PPL-3(Phosphataseofregeneratingliver-3，PRL-3)是现已发现与结直肠癌转移相关的少数特异性表达分子之[3]。PRL-3作为肿瘤转移研究中的“魅力”基因受到广泛关注[4-8]。应用基因表达系列分析(SAGE)技术分析结直肠癌肝转移基因表达谱时发现，PRL-3是在18例结直肠癌肝转移标本中唯一持续高表达的基因[3]。研究发现，大多数结直肠癌的转移标本中PRL-3的转录水平均明显增加[3,4]；而该基因在正常结直肠上皮或者非转移性原发结直肠癌中极少表达或不表达。不同的研究小组都分别证实了这一结果[5,6]。1PRL-3结构特点及细胞定位PRL-3基因位于染色体8q24.3,相对分子质量为22x103,是一类相对分子质量最小非典型磷酸酪氨酸蛋白之一[9]。Kozlov等[10]通过核磁共振技术证实,人的PRL-3二级结构是由一组5个α片层和6个β螺旋层面组成。其中β2(Me17-Thr22)、β3(Val45-Val48)、β4(Val65-Trp68)、β5(Cys99-Val102)相互平行,而α1(Val10-Ser13)与上述四链反向平行。螺旋的α1(Leu30-Tyr40)、α2(Lys55-Asp61)均同在片层的一侧,余下4个螺旋,包括α3(Lys79-Glu94)、α4(Ala111-Ser122)、α5(Lys125-Gln135)、α6(Lys144-Tyr152)则在片层的另一侧形成集束。Kim等[11]证实PRL-3的活性位点位于保守的磷酸酶标记序列VHCXXGXXR(103-110残基)。该序列中的Cys104是该酶的亲核基团,Arg110与之相协作。Asp72被认为起着广义酸的作用,位于襻中连接β4和α3。Zeng等[12]通过蓝菌素处理发现PRL-3聚集在微观中心附近的紧密折叠结构中,同时通过渥曼青霉素处理后PRL-3重新分布到肿胀的空泡状结构中,PRL-3的这些特征是典型的内涵体蛋白的特征。通过电镜免疫金标记技术发现PRL-3确实与细胞质和内涵体小房相关联。2PRL-3的生物学功能根据PRL-3基因和蛋白质的结构特征，它属于一类新近发现的蛋白质酪氨酸磷酸酶家族成员，该家族只有三个成员即PRL-1、PRL-2、及PRL-3。PRLs具有N末端PTP活性位点标签序列Cx5R，因而归属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族。然而这一类家族成员的催化域缺少大多数磷酸酶起催化作用所需的丝氨酸一苏氨酸残基。PRLs拥有单一的催化结构域，其C-末端含有-CAAX序列，可进行异戊烯化外，此外缺乏其他的辅助剪接、调节的结构域。PRLs以异戊烯化依赖方式存在于浆膜和内体(endosome)结构，这一生物化学特征提示它们在细胞信号传递中发挥作用[13]。家族中三个成员的蛋白质分子量大约为20KD，具有超过75%的同源性，在功能上具有相似性[14-16]。另外，PRL-3有29%氨基酸序列与酵母Sc.cerevisiaeCdel4P相同，后者与细胞周期调节有关，并在细胞核分裂中起重要作用[17]。而Kozlov等[18]用现代技术手段证实，人的PRL-3二级结构由一组5个p片层和6个a螺旋层面组成。由于该二级结构排列和其完全展开特征属于典型的双特异性磷酸酶结构，因此在结构上把PRL-3归属于磷酸酶家族成员。研究表明，PRL-1及PRL-3过度表达均可促进中国仓鼠卵细胞的迁移和侵袭[19]。但是，PRLS在生理条件下其组织分布存在明显差异，这提示它们在功能方面存在差异。3PRL-3相关的信号通路3.1MAPK信号通路Peng等[20]通过部分屏蔽人胎盘脑cDNA文库中的PRL-3,首次发现整合素α1蛋白与PRL-3的相关性,并且通过蛋白质相互作用和共同免疫沉淀实验证实了它们的联系。同时也发现PRL-3可以下调整合素酪氨酸磷酸化水平和上调Erk1/2的磷酸化水平。因为整合素介导的细胞黏附可以激活包括Erk1/2、c-jun激酶和p38的有丝分裂原激活蛋白酶(miogen-activatedproteinkinase,MAPK)家族,因此推断PRL-3可能通过影响MAPK信号转导通路而在侵袭和转移发挥作用。3.2PI-3K/AKT信号通路在DLD-1稳定过表达PRL-3的细胞中，PRL-3过表达可使丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT磷酸化和激活及AKT底物GSK-3p的磷酸化和失活，这一事件依赖于AKT上游激活因子PI-3K[21]。PRL-3对相关信号通路的影响与PRL-3对PTEN或Src功能的调节有关，其中间环节还不甚清楚。PRL-3可能通过下调PTEN的表达而间接激活AKT。PRL-3可通过促进PTEN的降解下调PTEN的表达。由于PTEN参与的相关信号通路十分广泛，因而PRL-3通过PTEN前言影响的信号通路也将十分广泛。PRL-3通过调节Src和PI-3K/AKT信号通路参与肿瘤发生过程中的上皮间叶转化(EMT)发生。PI-3K/AKT信号通路与上皮间叶转化关系密切。3.3整合素相关信号通路研究发现，PRL-3过表达可使上皮性标记物如E-cadherin、γ-连环蛋白及整合素即表达减少，使间叶性标志物snail和fibronectin表达增加[21]。整合素相关信号途径PRL-3除了可以与整合素α1直接相互作用[2]外，还可抑制整合素β1酪氨酸的磷酸化。PRL-3参与粘着斑(focaladhesion)相关分子如paxillin,vinculin的调节[21]。PRL-3对整合素相关信号通路影响很大程度上取决于PRL-3对P130cas的影响[22]，P130cas是重要的支架蛋白，通过在粘着点(adhesionsites)处与CrK和DOCK180的结合介导细胞迁移。PRL-3对整合素相关信号通路的调节与PRL-3对Src的影响关系密切[23]。PRL-3对Src的影响并非直接作用，而与PRL-3对CSK表达下调关系密切，而CSK可以磷酸化Src而降低其活性[23]。3.4Rho家族信号途径RhoGTP酶家族成员如Rho、Rac及Cdc42是细胞骨架的关键调节因子。它们调节肌动蛋白的聚合、应激纤维的组装、粘着斑及板状伪足、丝状伪足的形成。PRL-3可引起RhoA和RhoC的活性增加，Rac活性降低，对Cde42影响不明显，Rock抑制剂可以抑制这一效应[24]。Fiordalisi等[24]发现在结肠肿瘤细胞SW480中,表达了PRL-3的同时,有活性的RhoA和RhoC蛋白表达量增长了4-7倍,通过对Rho激酶的重要效应器的药理抑制,PRL-3介导的细胞活力和基质的侵袭力下降。提示酪氨酸磷酸酶激活Rho信号转导途径,促进细胞侵袭和活动性。总的来看，PRL-3参与的信号网络集中在PI-3MAKT信号通路、整合素相关信号途径及孙。家族信号途径，但是到目前为止直接的证据或联系仍有待研究证实，目前获得证实的相互作用蛋白或底物有3个，它们分别为ezrin[25]、整合素α1[26]及CDH22。4PRL-3与结直肠癌转移的关系PRL-3在肿瘤转移的作用与其促进细胞迁移和侵袭有关。将PRL-3转染到上皮细胞，可引起细胞形态发生改变，且形态改变与细胞运动能力相关[8]；PRL-3表达细胞表现出细胞运动力增加和体外侵袭能力增强[8,19]；另外，PRL-3可调节肿瘤细胞与细胞外基质的粘附[8]。PRL-3促进肿瘤转移与PRL-3酶活性有关。将转染野生型PRL-3的细胞经尾静脉注射入裸鼠体内，1-2周内即可形成明显的肺转移，甚至发生由广一泛肺转移引起的动物死亡；如果PRL-3失活则不引起明显的转移[19]。这一研究提示，PRL-3酶活化参与肿瘤转移，因而以PRL-3活性位点为靶点，筛选PRL-3活性抑制剂，可能获得结直肠癌转移抑制药物。还有研究发现PRL-3可阻止Angll调节蛋白P130cas的酪氨酸磷酸化，从而抑制细胞中由AngH诱导的胞内钙动员[27]。Kato等[28]将PRL-3特异性小干扰RNA转染到人结肠癌细胞DLD-1中,发现短暂下调细胞中PRL-3的表达减少了结肠癌细胞体外转移和体内肝脏聚集的现象。同时对人结肠癌组织标本检测发现,与不伴肝转移的病例的35.9%(52/145)相比,结肠癌伴肝转移病例中,PRL-3高表达明显升高为84.4%(27/32)。与不伴肺转移的病例的42.3%(71/168)相比,PRL-3高表达明显升高,为88.9%(8/9)。揭示了PRL-3高表达在结肠癌细胞的运动性和在肝脏、肺转移中的作用。Saha等[29]把转移的结直肠癌PRL-3基因表达和原发癌、良性结肠直肠肿瘤和正常结直肠上皮细胞的基因表达作对比,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时PCR等技术检测发现PRL-3在18例癌转移组织中均有高表达,而在无转移的肿瘤和正常结直肠上皮细胞中则表达很低。提示PRL-3基因对结直肠癌转移起重要作用。Bardelli等[30]通过原位杂交和免疫荧光技术等方法检测了PRL-3在结直肠癌转移到肝、肺、脑或者卵巢等器官中表达,但是在非结直肠癌转移到的相关器官中则不表达。同时发现PRL-3在正常结肠组织或者非转移的结直肠癌中不表达或者低表达。Peng等[31]用特异性单克隆抗体检测PRL-3在正常结直肠上皮中阳性表达率占7.1%(228)，在原发结直肠癌肿瘤中表达为23.9%(2188),在转移淋巴结中占53.7%(2241),而在肝转移组织中为66.7%(812)。PRL-3的表达强度和阳性率在常规结肠直肠上皮细胞与结肠直肠癌之间或在转移淋巴结和肝转移组织之间差异不明显。对比正常结直肠上皮细胞与结直肠癌,PRL-3表达率在转移淋巴结和肝转移组织中明显升高,而PRL-3在肝转移组织中表达水平比起其他两种情况都要高。5PRL-3在结直肠癌诊断和治疗中的研究由于PRL-3在结肠癌肝转移组织中的高表达,促使Li等[32]试图生产出PRL-3单克隆抗体,以期在结肠癌转移中成为潜在的诊断标记。通过部分屏蔽1400例的淋巴细胞杂交瘤克隆,传代出对PRL-3特异性单克隆抗体,并且在对人结肠腺癌组织免疫组织化学检测,发现有11.1%