PRVPCV-2PPV多重PCR试剂盒的研制

PRV、PCV-2、PPV多重PCR试剂盒的研制余波1谭诗文1冉懋韬1杨丽娟1徐景峨1史开志1（贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳550005）摘要：根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列，设计了3对引物，研制了检测PRV、PCV-2和PPV的多重PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带分别为300bp、420bp、680bp。敏感性、特异性结果显示，该试剂盒对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV45.2pg/L、PCV-235.7pg/L、PPV0.30ng/L，而猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）、大肠杆菌、猪支原体的扩增结果均为阴性。对125份自然感染病猪样品的检测结果表明，该试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该多重PCR试剂盒具有很好的特异性和敏感性，可用于临床PRV、PCV-2和PPV的检测。关键词：猪伪狂犬病病毒；猪圆环病毒2型；猪细小病毒；多重PCR随着规模化养猪的不断发展，当前猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）造成的猪繁殖障碍性疫病越发严重，常常出现混合感染，给养猪场造成了巨大的经济损失[1-3]。目前，主要的检测方法有病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、微量血清中和试验、ELISA、PCR方法。然而常规的诊断方法很难将此症状相似的疾病同时加以区别，而且常规的病原学和血清学检测方法，又存在操作繁杂、费时费力、敏感性低等不足。多重PCR（multiplexPCR，mPCR）诊断方法可一份样品中同时检测出多种病原体，且特异性和敏感性高、检测时间短、检测成本低，适合大量临床样品（特别是混合感染样品）中病原体的快速诊断。本研究根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列，设计了3对引物，研制了检测猪PRV、PCV-2和PPV的多重PCR试剂盒，对临床样品进行简便、快捷、灵敏、准确的检测，为RV、PCV-2和PPV的防制提供科学依据。1材料与方法1.1病毒和细菌基金项目：贵州省科技厅农业攻关项目黔科合NY字[2010]3085；贵州省畜禽健康养殖技术创新能力建设项目黔科合院所创能[2010]4004；中央补助地方科技基础条件专项基金项目[黔科条中补地(2010)4001]；贵州省农业科学院院专项黔农科院院专项[2008]040。作者简介：余波（1981-），男，四川人，助理研究员，硕士，研究方向：动物微生物与分子生物学。E-mail：[e-mail]。通讯作者：谭诗文（1956-）。PRV、PCV-2、CFSV石门系株、PRRSV美洲株株、大肠杆菌、支原体为本研究室保存。1.2主要试剂Goldview、Tris、EDTA、DL2000、TaqDNAPolymerase（5U/µL）及相应10×TaqBuffer、dNTP等购自宝生物（大连）工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。1.3引物设计根据GenBank中登录的(PRV)gE、PCV-2ORF2和PPVVP2基因组序列，应用DNAStar软件，设计了3对引物，用于扩增PRV、PCV-2、PPV目的基因片段，引物的序列。PRV上游引物：5’–CCCACGCACGAGGACTAC–3’，PRV下游引物：5’–GGGCGGGACATCAACAGG–3’，目的片段大小300bp。PCV-2上游引物：5’–GGATTGTATGGCGGGAGG–3’PCV-2下游引物：5’–AGGAGGCGTTACCGAAGGAG–3’，目的片段大小420bp，PPV上游引物：5’–GGGAGGGCTTGGTTAGAATC–3’，PPV下游引物：5’–TTGTTTGCCATGAGTGAGTT–3’，目的片段大小680bp。1.4病毒核酸的抽提取待检样品肝、脾、肺、淋巴结、扁桃体、脑等组织样品共约0.2g，加入500µLPBS缓冲液，待检样品研磨后－20℃反复冻融3次12000r/min离心取上清用于病毒核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA和RNA于－70℃保存。支原体、大肠杆菌DNA用煮沸法提取DNA。1.5单一病毒PCR扩增单一病毒的PCR反应在25µL体系中进行，Primer1/2各1µL、10×TaqBuffer5µL、dNTPmixture2µL、TaqDNApolymerase0.5µL、ddH2O加至25µL，反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。取5µLPCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。1.6多重PCR反应条件的优化对多重PCR反应条件，包括退火温度（54～60℃），引物浓度（5～20µmol/L），TaqDNApolymerase浓度（0.5～3.5U）进行优化，以确定最佳反应条件，同时以双蒸水作为空白对照。多重PCR反应在50µL反应体系中进行，10×TaqBuffer10µL，dNTPmixture8µL；TaqDNApolymerase1µL，用双蒸水补足至50µL。反应条件为：94℃5min；94℃1min，54～60℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。取5µLPCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。1.7敏感性试验将提取的病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，为将3种病毒DNA混合，经5倍系列稀释的病毒核酸用于多重PCR反应；经10倍系列稀释的病毒核酸用于单一病毒的PCR反应。1.8特异性试验以PRV、PCV-2、PPV、支原体、E.coli为模板分别进行多重PCR反应，CSFV和PRRSV反转录为cDNA进行多重PCR反应。1.9重复性试验应用试剂盒，重复检测PRV、PCV-2、PPV单一病毒DNA或混合DNA样品3次以检验结果的可靠性。1.10试剂盒的保存期检测将试剂盒保存在4℃、-20℃分别于3月、6月、1年，对阳性样品进行检测，以确定试剂盒的保存时间。1.10多重PCR试剂盒对临床样品的检测对2011年至2012年贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、六盘水市、铜仁地区、瓮安县几个规模化养猪场和养猪专业户采集的125份病料进行检测。2结果2.1PCR产物的鉴定PRV、PCV-2、PPV的PCR扩增片段经胶回收，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段分别为各病毒的特异性条带。2.2多重PCR反应多重PCR反应在50µL反应体系中最佳反应条件为，退火温度55℃，TaqDNApolymerase1U，引物浓度10µmol/L用各病毒的特异性引物均有效扩增出了其目的片段，分别为300bp(PRV)，420bp(PCV-2)、680bp(PPV)，引物间无非特异性片段产生（见图1）。2.3敏感性试验在多重PCR反应中，病毒的最低检测量分别为PRV45.2pg/L、PCV-235.7pg/L、PPV0.30ng/L（见图2）。在单一病毒的PCR反应中，各病毒的最低检测量分别为，PRV28.7pg/L、PCV-216.4pg/L、PPV95.3pg/L（见图3、4、5）。图1PRV、PCV-2和PPV多重PCRM:DL2000；1：PRV、PCV-2和PPV多重PCR产物；2：PRV单一PCR产物；3：PCV-2单一PCR产物；4:PPV单一PCR产物；5:多重PCR空白对照图2PRV、PCV-2和PPV多重PCR敏感试验M:D2000；1～9：5－1～5－10稀释的病毒DNAPCR结果.图3PRV单一病毒PCR敏感试验M:D2000；1～9：10-1～10-8稀释的病毒DNAPCR结果.图4PCV-2单一病毒PCR敏感试验M:D2000；1～9：10-1～10-8稀释的病毒DNAPCR结果.图5PPV单一病毒PCR敏感试验M:D2000；1～9：10-1～10-8稀释的病毒DNAPCR结果.2.4特异性试验以CSFV、PRRSV、支原体、E.coli为模板分别进行多重PCR反应均未扩增出条带，而PRV、PCV-2、PPV人为混合DNA均扩增出各病毒的特异性条带（见图6）。2.5重复性试验应用建立的多重PCR方法，重复检测PRV、PCV-2、PPV单一DNA或人为混合DNA样品3次，结果均一致。2.6试剂盒的保存期检测将试剂盒保存在4℃、-20℃分别于1月、3月、6月、1年，对阳性样品进行检测，4℃保存1年条带较淡，-20℃保存1月、3月、6月、1年条带亮度无影响。2.6多重PCR试剂盒对临床样品的检测利用试剂盒对125份临床病料进行检测。125份疑似病料中有52份PRV阳性，阳性率最高，为41.60%（52/125）；21份PCV-2阳性，阳性率为16.8%（21/125）；37份PPV阳性，为29.6%（37/125）。其中PRV、PCV-2和PPV三重感染7份；PRV和PPV双重感染24份；PRV、PCV-2双重感染12份；PPV、PCV-2双重感染14份。其结果与单一病毒PCR检测结果的符合率为100％。3讨论猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒严重危害养猪业的发展，它图6PRV、PCV-2和PPV多重PCR试剂盒特异性试验M:DL2000；1：PRV、PCV-2和PPV多重PCR产物；2：PRV多重PCR产物；3：PCV-2多重PCR产物；4:PPV多重PCR产物；5:支原体多重PCR产物；6：CSFV多重PCR产物；7：PRRSV多重PCR产物；8：E.coli多重PCR产物.们的共同致病特征是都能导致断奶仔猪多系统衰竭征及猪繁殖障碍[4-7]。随着分子生物学的发展，PCR方法已经成为众多病原检测和分析的主要手段。本研究中的3种疾病病原均是DNA病毒，本研究研制的多重PCR试剂盒可以在同一个反应体系中同时检测3种病毒，能够对临床样品中PRV、PCV-2和PPV单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定，结果表明，该试剂盒敏感性好、特异性高，具有广阔的应用前景。多重PCR试剂盒中引物的设计至关重要，本研究设计的引物根据PRVgE基因、PCV-2ORF2基因、PPVVP2基因相对保守的基因序列的。在设计引物时，设计PRV、PCV-2和PPV这3对引物在相近的退火温度进行多重PCR扩增是多重PCR反应成功与否的关键[8]。本研究应用试剂盒对临床病料检测结果显示，PRV、PCV-2和PPV存在混合感染的情况，阳性率为5.6%，PRV、PCV-2和PPV可造成机体免疫抑制，造成多种疫病继发感染，使病情加重、药物的有效性差。针对目前规模化猪场疫病的复杂局面，树立保健和预防观念，采取合理的免疫程序，建立完善的预防方案。同时对患猪制定科学的用药方案，正确配伍，协同用药，辨证施治，综合治疗。参考文献：[1]李小康,赵丽,崔保安,等.多重PCR检测猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究[J].中国预防兽医学报,2009,29(3):227-230.[2]黄章生,黄绍明,符建海,等.一例猪伪狂犬病和细小病毒病混合感染的诊治报[J].中国兽药杂志,2008,42(10):57-58[3]吕艳丽,杨汉春,郭鑫,等.猪圆环病毒2型的分离与鉴定[J].中国兽医志,2004,40(2):14-18.[4]王泽洲,余勇,吴越,等,猪生殖障碍性疾病的研究概况[J].中国兽医科技,2007,37(9):823-826.[5]StrawBE,ZimmermanJJ,D’AllaireS,etal.Diseasesofswine.9thedition.Iowa:Blackwellpublishing,2006:299-308.[6]QuintanaJ,SegalesJ,RosellC,etal.Clinicalandpathologicalobservat