miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及机制

中国组织工程研究第20卷第11期2016–03–11出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchMarch11,2016Vol.20,No.11P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·李连冲，男，1979年生，汉族，郑州大学医学院毕业，主治医师，主要从事心脏血管外科方面的研究。中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)11-01584-07稿件接受：2016-01-27细胞向心肌细胞分化的影响及机制李连冲(南阳医学高等专科学校第一附属医院心血管外科，河南省南阳市473000)引用本文：李连冲.miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及机制[J].中国组织工程研究，2016，20(11):1584-1590.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.010ORCID:0000-0002-7557-8873(李连冲)文章快速阅读：文题释义：微小RNA：肿是内源性的非编码单链小RNA，它通过与靶基因mRNA3’UTR区域结合，引起mRNA降解或阻止其翻译从而调控基因表达。一个miRNA可以调控众多基因的表达，几个miRNA也可以组合来精细调控某个基因的表达。据报道目前总共有16,772个miRNA，miRNAs几乎参与了每一个生物学过程。心肌细胞：又称心肌纤维，有横纹，受植物性神经支配，属于有横纹的不随意肌，具有兴奋收缩的能力。呈短圆柱形，有分支，其细胞核位于细胞中央，一般只有一个。各心肌纤维分支的末端可相互连接构成肌纤维网。广义的心肌细胞包括组成窦房结、房内束、房室交界部、房室束(即希斯束)和浦肯野纤维等的特殊分化了的心肌细胞，以及一般的心房肌和心室肌工作细胞。摘要背景：既往研究发现，miR-25在向心肌分化的P19细胞中的表达水平显著低于其在未分化的P19细胞中的表达水平，但是其对心脏发育的影响及其机制尚不明确。目的：探索miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及其机制。方法：体外培养P19细胞并向心肌细胞诱导分化。通过实时反转录PCR检测miR-25在向心肌分化的和未分化的P19细胞中的表达水平。通过脂质体转染构建miR-25过表达的P19细胞，观察miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响。通过miRNA靶基因预测数据库预测miR-25的靶基因，并利用荧光素酶报告基因实验检测miR-25对Pax3的靶向作用，沉默Pax3，观察Pax3对P19细胞向心肌细胞分化的影响。结果与结论：miR-25在分化的P19细胞中表达水平较低。miR-25过表达能够促进P19细胞向心肌细胞分化。靶基因预测分析Pax3为miR-25潜在的靶基因，荧光素酶实验进一步证实Pax3是miR-25的直接靶点，Pax3沉默促进P19细胞向心肌细胞分化。提示miR-25通过靶向Pax3促进P19细胞向心肌细胞分化，为心脏发育以及先天性心脏病的防治提供新的线索和理论依据。关键词：组织构建；组织工程；心肌细胞；miR-25；P19细胞；分化；先天性心脏病；Pax3miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响探索miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及其机制RT-PCR检测miR-25在向心肌分化的和未分化的P19细胞中的表达水平脂质体转染构建miR-25过表达的P19细胞，观察miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响。体外培养P19细胞并向心肌细胞的诱导分化miRNA靶基因预测数据库预测miR-25的靶基因荧光素酶实验检测miR-25对Pax3的靶向作用细沉默Pax3，观察Pax3对P19细胞向心肌细胞分化的影响李连冲.miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及机制ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1585主题词：肌细胞，心脏；微小RNA；细胞分化EffectofmiR-25onthedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytesanditsmechanismLiLian-chong(DepartmentofCardiovascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofNanyangMedicalCollege,Nanyang473000,HenanProvince,China)AbstractBACKGROUND:PreviousstudieshavefoundthattheexpressionlevelofmiR-25indifferentiatedP19cellsissignificantlylowerthanthatinundifferentiatedP19cells.However,theeffectofmiR-25oncardiomyogenesisandtherelevantmechanismremainunclear.OBJECTIVE:ToexploretheeffectandmechanismofmiR-25onthedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytes.METHODS:P19cellswereculturedanddifferentiatedintocardiomyocytesinvitro.TheexpressionofmiR-25indifferentiatedandundifferentiatedP19cellswasdetectedbyreal-timePCR.miR-25-overexpressingP19cellswereconstructedbylipofectiontransfection,andwereusedtoinvestigatetheeffectofmiR-25onthedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytes.MicroRNAtargetanalysistoolswereusedtoexplorepotentialtargetsofmiR-25,anddualluciferasereporterassaywasusedtoidentifywhetherthe3’UTRofPax3mRNAwasabindingtargetofmiR-25.Inaddition,wetransfectedP19cellswithPax3shRNAstosilencetheexpressionofPax3,andinvestigatedtheeffectofPax3onthedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytes.RESULTSANDCONCLUSION:ExpressionlevelofmiR-25indifferentiatedP19cellswasobviouslydown-regulatedcomparedwiththatinundifferentiatedP19cells.miR-25overexpressionpromotedthedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytes.Bytargetpredictionanalysis,weconfirmedthatPax3wasapotentialtargetgeneofmiR-25.LuciferaseassayfurtherconfirmedthatmiR-25targetedPax3directly.Moreover,knockdownofPax3promotedthedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytes.Takentogether,miR-25promotesthedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytesbytargetingPax3.Thesefindingsoffernewcluesandtheoreticalbasisforcardiomyogenesisandpreventionandcureofcongenitalheartdisease.Subjectheadings:Myocytes,Cardiac;MicroRNAs;CellDifferentiationCitethisarticle:LiLC.EffectofmiR-25onthedifferentiationofP19cellsintocardiomyocytesanditsmechanism.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(11):1584-1590.0引言Introduction先天性心脏病是最常见的先天畸形之一，在中国的发病率为0.7%-0.8%，中国每年新增加的先天性心脏病患儿大约15万[1]。据报道先天性心脏病发病的主要原因是胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程受损，而基因因素对该受损过程的发生起了重要作用[2-3]。心脏是脊椎动物胚胎发育最早形成并发挥功能的重要器官，其形成是一个极其复杂而精密的过程，包括遗传调控程序在空间和时间上相互协调，许多相关基因的顺序表达以及多条信号通路(如Wnt信号通路、FGF信号通路、骨形态发生蛋白信号通路、Notch信号通路等)的激活和精确调控，其中任意基因的缺失或突变都可能会导致心脏发育畸形[4]。因此，从基因和分子水平上来探索心脏的形成和发育机制为先天性心脏病的预防和治疗提供了新的方向。微小RNA(miRNA)是由19-23个核苷酸组成的非编码的小RNA分子，它通过与靶基因mRNA3’UTR区域结合，引起mRNA降解或阻止其翻译从而调控基因表达。生物信息学分析表明每个miRNA调控成百上千基因，而且miRbase数据库()公布的数据显示目前共发现16772个miRNAs，这也从侧面表明了miRNAs几乎参与了每一个生物学过程[5-6]。已有研究证实miRNAs参与并调控时序发育、细胞增殖、分化、凋亡、衰老以及激素分泌等多种生理过程[7-8]。很多研究也报道了miRNAs在人类各种疾病的发生、发展和预后中发挥着重要的作用[9-20]。目前，它们在心肌细胞分化以及心脏发育过程中的重要作用受到了广泛关注。越来越多的研究证实miRNAs对心脏发育起着重要的调控作用[21-25]。但是miRNAs致胚胎心脏发育畸形的精确机制尚未阐明，因此继续发掘新的与心脏发育相关的miRNAs，寻找其下游的靶分子，并探究其对心脏发育LiLian-chong,Attendingphysician,DepartmentofCardiovascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofNanyangMedicalCollege,Nanyang473000,HenanProvince,China李连冲.miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及机制P.O.Box10002,Shenyang110180的分子调控机制依旧非常重要。P19细胞从C3H/He雄性小鼠的畸胎瘤中分离获得，是一种能够在体外培养的多能干细胞，具有自我复制和分化的潜能。在低浓度的二甲亚砜诱导下，P19细胞可分化为心肌样细胞，这一过程被用于模拟心脏发育，目前已经作为心肌细胞模型广泛应用于心脏发育的分子机制研究中[26]。因此在本研究选择P19细胞作为研究对象。miR-25是近期受到广泛研究的miRNA，其在多种疾病中发挥重大的作用，尤其是在癌症中。已有研究报道miR-25促进胆管癌、卵巢癌、胃癌、食管鳞癌、宫颈癌、胶质瘤等恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移