MPN法测反硝化细菌的数量

MPN法测定土样中的反硝化细菌数量实验步骤（假设有8个土样）实验器材：100mL锥形瓶48只，250mL锥形瓶10只（2只用于制取无菌水，8只用于配土壤悬浊液），120根试管，120个试管硅胶塞、滴管、白瓷比色板、移液枪及吸头、洁净工作台、恒温培养箱等。①配置培养基KNO32g，MgSO4·7H2O0.2g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，柠檬酸钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2。②配置无菌水用2只250mL的三角瓶装满蒸馏水，用密封膜封口。再用8只250mL的三角瓶装100mL的蒸馏水，也用密封膜封口。③将培养基配制好后装入试管中，用移液枪向每管中装10mL培养基，培养试管中应放入一倒置杜氏发酵管，以检测气体的生成）,塞上硅胶塞，121℃灭菌30min。每个样品需培养基15管（5个稀释倍数，每个稀释梯度3个平行），共120个培养基。④称取新鲜土样10g，共8个土样，迅速倒入盛有三四十粒玻璃球的100mL无菌水的250mL三角瓶中。置于摇床上振荡30min，制成10倍的样品稀释液。静止30s后，用1mL灭菌吸管吸1mL10倍稀释液加入9mL无菌水中（注意勿使吸管碰到无菌水），摇匀及制成100倍稀释液，然后将悬浊液稀释成一系列梯度（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）,每个土样需要6个锥形瓶。⑤取出灭菌分装好的各培养基试管，用无菌吸管接种样品的稀释液1mL，每个稀释度接种3管，另取3管培养基接种1mL无菌水作为对照。于25~30℃中恒温培养箱中培养，培养周期为14天。反硝化细菌的测定培养14天后检查是否有菌生长，如果有细菌生长，杜氏发酵管中有气泡出现，培养液变浑浊。用纳氏试剂检查是否有氨产生，其法是于白瓷比色板上去培养基5滴，加上奈氏试剂2滴，如果有NH3存在，则呈黄色或褐色沉淀。再用格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ检测有无亚硝酸盐生成（方法是取出5滴培养液于白瓷比色板上，加入格利斯试剂第一或者二各两滴，如果有亚硝酸存在则呈红色），如果不呈红色则表明亚硝酸已完全消失。此时用二苯胺试剂检测硝酸盐，另取5滴培养基于白色比色板上，加入二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表明亚硝酸已被氧化成硝酸。检测试剂（1）纳氏试剂：甲液：称取20g碘化汞和10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。乙液：称取20g氢氧化钾溶于100mL蒸馏水中。分别配制甲乙溶液，冷却后混合，放置2天后使用，保存于棕色瓶中，取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。（2）格里斯试剂（GriessReagent）I和Ⅱ：试剂I：将0.5g的对氨基苯磺酸（SulfanilicAcid）加到150mL的20~30%稀醋酸溶液中（用100mL冰醋酸家400mL蒸馏水），保存于棕色瓶中。试剂Ⅱ：将1gα-萘胺（α-naphthylamine）加到20mL蒸馏水中和150mL的20%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。（3）二苯胺试剂：溶0.5g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20mL蒸馏水及100mL浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。