拉曼光谱技术在生物体系研究中的应用

拉曼光谱技术在生物体系研究中的应用彭红军周光明*黄成(西南师范大学化学化工学院重庆400715)摘要介绍了近五年来应用拉曼光谱研究核酸及其组分、蛋白质及其组分和生物组织等生物体系及其与其它物质相互作用的研究概况，展望了该技术在生物体系的应用前景。关键词Raman光谱核酸蛋白质生物组织TheApplicationofRamanSpectroscopytoBiologicalSystemsPengHongjun,ZhouGuangming*,HuangCheng(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SouthwestChinaNormalUniversity,Chongqing400715)AbstractTheadvancesintheapplicationofRamanspectroscopytobiologicalsystemsincluding:nucleicacidsandtheirconstituents,proteinsandtheirconstituents,tissueaswellastheinteractionsofthesesystemsandtheothermoleculesareintroduced.Theperspectiveisalsogiven.KeywordsRamanspectroscopy,Nucleicacids,Proteins,Tissue上世纪60年代年激光的问世并被引入到拉曼光谱领域，使得拉曼光谱效应太弱的缺陷被攻克，从而打开了拉曼光谱应用研究的新局面。至目前，拉曼光谱已广泛应用于有机、无机、高分子、生物、环保等各个领域，成为重要的分析方法和手段。随着科技的进步，近几年来又相继发展了表面增强拉曼、傅里叶变换拉曼、共聚焦拉曼、显微拉曼、紫外共振拉曼、时间分辨拉曼等新技术，拉曼光谱在分子结构(特别是高分子结构)研究中的作用正日趋重要。特别是，由于水的散射光谱极弱，对其它物质的拉曼散射影响甚微，拉曼光谱在水溶液方面的应用更是具有得天独厚的优势。生物大分子多是处在水溶液环境中，因此研究它们在水溶液中的结构对于了解生物大分子的结构与性能的关系很是重要。拉曼效应对于分子构象的变化敏感，且测量时样品用量很少，可低至数µg，加之拉曼光谱仪本身的不断改进，使拉曼光谱已成为一种能够快速、详尽提供有关水溶液中生物大分子结构信息的新技术。已经有综述总结了拉曼光谱在生物体系上的应用方面的文章[1]，本文重点针对最近五年来国内外的最新资料尤其是生物体系与其它物质相互作用方面的资料进行归纳和相关总结。1拉曼光谱应用于生物体系的进展现状1.1核酸及其组分目前对于核酸的研究，主要集中在核酸及其组成在其它表面的吸附方式和它们与其它物质的相互作用方面。单纯研究其构象变化的报道在近几年已经逐渐减少，并且转向到在外界条件如温彭红军男，30岁，硕士生，现从事光谱学研究。*联系人，E-mail:[e-mail]2004-06-30收稿，2005-02-06接受度、pH、光照等的变化所引起的构象改变的研究[2,5]。为了使实验数据能更好地表征结构，人们更多的把拉曼光谱的实验方法和相关的计算方法紧密联系了起来，以确证拉曼峰的归属。如孟耀勇[6]利用晶格动力学方法计算了三螺旋DNA分子poly(dT)·poly(dA)·poly(dT)碱基振动模式，并根据势能分布矩阵对碱基振动模式进行了指认。1.1.1核酸及其组分在表面的吸附方式对于核酸及其组分在其它表面的吸附方式的研究，目前仍以表面增强拉曼散射(SERS)为主要技术手段，以金、银的膜或电极或溶胶为主要吸附表面作为研究的重点。拉曼光谱特别是SERS谱不仅能提供样品在表面的吸附活性位点，而且能提供吸附机制以及吸附方式随环境条件的变化而变化的信息。氢键在碱基吸附于表面过程中起了决定性的作用：既通过氢键吸附于表面之上，又通过氢键的竞争从表面解吸[7,8]。而较低浓度下，核糖则是DNA在银溶胶中的吸附活性部位[9]。这些物质在表面上的吸附取向因条件特别是电位的变化而变化，如尿嘧啶在银表面的吸附取向是由其浓度和银表面电位共同决定的，在较低浓度和较高电位时，Ｎ(3)去质子化的尿嘧啶离子在银表面主要是通过Ｃ(2)及整个嘧啶环上的π电子体系与银表面的相互作用平躺地吸附；在较高浓度和较低电位时，吸附取向发生改变，即主要是通过Ｎ(3)与Ｏ(10)以及Ｎ(3)与Ｏ(8)垂直地共同吸附在银表面上[10]。董丽琴等[11]对金基体上自组装寡聚核苷酸探针杂交前后进行电化学非现场及现场表面增强拉曼光谱研究的结果表明，杂交形成的dsDNA在基体表面以A型和B型两种构象同时存在，杂交过程可能伴随DNA链在基体表面吸附取向的变化，且ssDNA及dsDNA的大多数SERS谱带强度随电极电位正移而降低，尤其是归属于碱基A的两种面外振动模式，谱带变化更为明显。利用SERS表面选择定则判断出随着电极电位由负向正变化，ssDNA及dsDNA螺旋吸附取向由垂直吸附向平躺吸附于金基体表面变化。1.1.2核酸与其它物质相互作用机理核酸与其它物质反应机理的研究，对于寻找抗癌药物或阐明药用机理以及毒理等方面都有极其重要的意义，这也是近几年拉曼光谱在生物体系研究上的重点和热点。众多研究表明，药物与DNA的反应主要是通过药物的配体、杂环等部位与DNA的插层反应完成的[12~14]。王树玲等[15]用表面增强拉曼光谱研究了小檗碱与小牛胸腺DNA的相互作用。在Ag胶体系中，可能是小檗碱分子的异喹啉部分键合到DNA的小沟槽，与DNA的相互作用模式主要是通过静电力及疏水相互作用。目前，化学类药物与核酸反应的拉曼光谱研究就药物品类来说已经比较广泛，但对生物物质与核酸反应的拉曼光谱研究还有待加强。1.2蛋白质及其组分目前对蛋白质及其组分的研究正处于热点时期。就拉曼光谱方向而言，研究的焦点一是单独研究其光谱特征以及在其它表面吸附的拉曼光谱，二是研究它们与其它物质的相互作用过程和方式。1.2.1蛋白质及其组分的拉曼光谱特征掌握氨基酸及其衍生物晶体的光谱特征对于研究蛋白质的性质及反应极具意义。低于295K的低温条件下，部分氨基酸晶体的拉曼振动归属得以解决，且低温下一定的温度变化范围内，氨基酸或其衍生物的晶体(或单晶)会发生相的转换甚至发生结构的二次变化[16~18]。Silva等[19]在室温下利用拉曼光谱发现L-苏氨酸晶体在不同压力(20.3～22.4kPa)间发生了相的转换，伴随着这种转换，其光谱的振动区域、波数-压力曲线以及各波段的相对强度均发生突变，尤其是相关的氢键。Ramaswamy等[20]通过对鸟氨酸硝酸盐晶体的FT-IR光谱研究发现，羰基是以COO－离子的方式存在于晶体中，晶体中N－H…O氢键的形成对晶体的内聚力作了显著的贡献。但是目前各种氨基酸单晶的拉曼谱图尚不完善。对蛋白质分子的拉曼光谱研究，所采用的对象主要有病毒蛋白、酶蛋白、血红蛋白、角蛋白和它们的配合物等，用以探索蛋白质分子在其它表面上的吸附机制、结构及结构转化以及分子内部的键的振动等。蛋白分子与银表面产生化学吸附而产生拉曼增强，增强机制主要为分子增强，但芳香族氨基酸侧链的π-电子复合物和分子基团的σ-复合物的存在，使增强具有短程特性；相应谱带的拉曼增强效果与分子基团处于银表面的几何状态有关，且a螺旋构象更容易通过N原子吸附于胶体表面[21~25]。分析氨基酸残基、二硫化物联桥、酰胺I和III带等构象敏感拉曼波段，是了解蛋白质分子结构及结构转化、配体对构象的影响[24]等信息的重要手段。Thomas等[25]研究了氨基酸侧链局部相互作用的氢键，解决了在X射线和核磁共振理论中都不容易理解的半胱氨酸的巯基氢键(SOH…X)的特性和强度，并揭示出天然蛋白质中迄今尚未被承认的巯基氢键的多样性。pH对蛋白质二级结构有较大的影响，可以用来探索蛋白分子折叠过程，但是蛋白质分子对pH变化的敏感程度并不一样[26,27]。Zhao等[28]利用紫外共振拉曼光谱(UVRR)所得的与酪氨酸和色氨酸残基相关的信号差异确定了血红蛋白异构化过程中的三种动力学相位。利用419nm脉冲泵将CO加合物进行充分光分解，得到229nm探针脉冲作用下产生的一系列时间延迟的UVRR光谱，得出相应的异构化时间，并用该方法研究了化学交联对血红蛋白异构化的影响，结果表明化学交联加速了异构化中的一个中间转化过程。1.2.2蛋白质与其它物质相互作用机理蛋白质与其它物质相互作用也是近几年研究的重点和热点，这对于探索病变及免疫机理，找寻特效药物等都具有极其重要的意义。首先是反应位点的确定。异吡嗪环容易接受到自配体迁移来的电荷，使其拉曼振动得到选择性增强，在任何反应机制下，该增强区域都是亲核进攻或电子转移的首选目标位置，从而详细而精确的反映了蛋白质分子与其它分子间相互作用的反应位点[29,30]。在分子免疫方面，抗原与抗体之间的作用位点的研究也具有重要意义并取得了一定的进展。王连英等[31]用银纳米粒子SERS效应，研究了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和其鼠源单克隆抗体(单抗，AbHBsAg)的相互作用。结果表明，HBsAg与AbHBsAg相互作用形成免疫复合物后，HBsAg分子上的色氨酸(Trp)残基特征振动完全消失，表明Trp残基位于HBsAg抗原分子的活性区，是HBsAg与AbHBsAg相互作用的重要位点。活性复合体的构造常常对反应产物有重大影响。这对更好地在分子水平理解反应机理来说是个至关重要的信息。在所有的分子手段中，拉曼光谱可能是最方便提供这种信息的。蛋白质分子在一些特异的高亲合结合部位发生配位作用形成配合物，如某些金属离子和蛋白的N末端强结合部位发生强配位作用,或者这些金属离子与肽键上的C=O及边链羧基上的C=O配位，都将引起构象突变；由于氢键的作用或者由于连接在b型结构边沿上的表面环的构象发生变化等原因，都将在一定程度上修改蛋白质的二级结构(使b平面构型和a平面构型数量关系发生变化)，但变化决定于配基的种类和性质[32,33]。Noto等[34]为了更好地理解Al(Ⅲ)是如何改变蛋白酶的生物学特征，利用拉曼和FT-IR法研究了Al(Ⅲ)和胰蛋白酶相互作用的结果，结果表明Al(Ⅲ)改变了胰蛋白酶的二级结构，特别是在溶液中该蛋白质和铝离子的反应导致了直立结构百分含量的减少和平面结构百分含量的增加，并且是随意缠绕的。这些研究既可用于病理或毒理的探索，也可用于药物的开发，从而为人类的健康事业和科学的进步作出贡献。1.3生物组织以拉曼光谱直接研究生物组织是近几年拉曼光谱研究领域的重大突破，对于更加快捷、准确进行疾病的分子诊断具有重要意义。目前所报道的研究对象已经涉及多个组织。皮肤是人体最大的组织，在拉曼光谱研究中颇受青睐[35]。Petersen等[36]对古埃及木乃伊不同部位的皮肤作了拉曼光谱研究，为考古学提供了新的参考依据。大脑皮质和纹状体在梗塞前后的拉曼光谱表现出较大的差异，证明用该方法研究组织的生物大分子功能基团的分布是可行的[37]。帕金森病与脑中央喙体的塞梅林氏神经节有直接的关系，处理过的和未经处理的塞梅林氏神经节的拉曼光谱表明神经原核质的染色过程影响了脑细胞[38]。Erckens等[39]用共聚焦拉曼光谱技术监控了兔角膜非侵入性药至水合变化过程，观察到角膜中水容量的变化。通过计算水羟基在3390cm-1的振动和蛋白质中CH在2945cm-1处的拉伸振动的拉曼强度比率来确定角膜的水合状态。这种方法有可能监控到活的角膜的水合状态。此外，心包膜组织、血红细胞、成骨细胞、植物的芽孢等也都在研究之中[40~43]。图1人体肺组织的拉曼光谱Fig