Non-codingRNAskeyregulatorsofmammaliantranscriptio

哺乳动物转录关键调控因子—非编码RNA非编码RNA（ncRNAs）在控制许多生物进程的活化中起重要作用，事实上，转录产物同时也能反过来控制转录进程。在过去的几年里，人们发现ncRNA不仅可以调节单个基因还可以控制整个转录过程，它在发育或环境信号的作用下影响成百上千个基因的表达。与传统的蛋白质调节因子相比，可以调节哺乳动物细胞mRNA转录的ncRNA还很少，但是发现新的ncRNA转录调节因子的速度却很快，这说明随着该领域的发展，基因表达的调控模型将被重新定义。ncRNA是哺乳动物转录的关键调控因子由于ncRNA在调节细胞基础过程的活化中起着越来越重要的作用，转录是由蛋白质因子介导调节的观点已经发生了改变。此外，随着高通量测序技术的出现，我们发现大多数哺乳动物基因组中的DNA是被转录的。这一发现也引出一个问题，是否所有的细胞转录都是受ncRNA调控还是仅仅是转录噪声的副产物。虽然这些问题仍然是议论的焦点，但是已经有越来越多的具有生物学功能的ncRNA被发现，且具有多种功能有些甚至直接控制基因的表达。在这篇综述中，我们讨论了最近一些哺乳动物ncRNA功能的研究进展，关于调节基因表达的第一步：RNA聚合酶II介导的蛋白质编码基因的转录，我们主要讨论长度超过200nt的长链ncRNA（lncRNA）。LncRNA转录调控因子大概可分为两类：调控染色质变化的和调节转录因子活性的，两种类型的RNA的区别还不是特别清楚。下文中的例子虽然不能代表所有的，但是对于突出lncRNA转录调节因子不断发展的主题却很有意义。本文没有讨论关于Xist（X-非活性特异性转录本）和介导基因组印记的lncRNAs的例子，因为之前已经有文章介绍过了。词汇表：1、染色质免疫共沉淀-芯片（ChIP-chip）：是一项用于确定基因组与蛋白质相互关系的技术，通过特定抗体纯化蛋白及任何与甲醛交联细胞相关的染色质。可逆交联后，染色质与芯片杂交，该芯片含有基因组序列从而可以确定蛋白在细胞中的结合区域。此外，染色质还可以通过深度测序来确定蛋白质占用的全基因组位点。2、染色体构象捕获碳拷贝法（5C）：是一项分析细胞内某处的三位组织形式的技术，它能够使研究者评估长距离染色体的相互作用。3、顺反式调控：相对于lncRNAs，顺式调控因子主要控制lncRNA转录所在的或者接近区域的转录，而反式调控因子则主要控制基因组中被删除的转录位点的转录（通常在不同的染色体上）。4、基因隔离：一种保护基因不受外界相互作用的过程，这种相互作用会导致基因不适当激活及沉默。当基因组的相邻区域具有不同的转录模式时我们会使用基因隔离。5、异质性胞核核糖核蛋白（hnRNRs）：一类结合ncRNAs的蛋白质家族，hnRNPs参与多种生物过程包括转录、转录前处理、RNA转运及翻译。6、PcG蛋白复合物2（PRC2）：由Ezh2、Suz12、EED和RbAp48组成的多亚基复合物，Ezh2是一种主要负责三甲基化组蛋白H3的27位赖氨酸的组蛋白甲基转移酶（H3K27me3），这种组蛋白修饰是染色质转录沉默的标志，PRC2在基因组的转录抑制中发挥着主导作用。7、RNA适配子：与目标蛋白结合非常紧密的小分子RNA（通常是非天然的），适配子通常由体内筛选过程产生（也称为SELEX，指数富集的配基系统进化技术），该过程主要是从大量结合在某个靶标的随机序列中反复筛选和放大从而得到适配子。8、小核核糖核蛋白（snRNP）：一种结合小核RNA（snRNA）的蛋白质复合物，比如一种snRNA，7SKRNA就与一种叫做7SKsnRNP的蛋白质复合物有关。ncRNA通过调节染色质结构的变化控制转录染色质的结构（DNA和组蛋白组成真核基因组）调控DNA与PolII、转录因子的结合，因此在转录调控中至关重要。染色质结构可以被特异的翻译后组蛋白修饰所改变如甲基化和乙酰化，如基因启动子的组氨酸H3的4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）、转录区的H3K36me3与基因活化有关，而H3K9me3、H3K27me3和H4K20me3则与基因抑制有关。酶复合物介导的组蛋白甲基化标记已经被初步了解，如这些复合物如何靶向特定基因区域以及特异性修饰染色质区域的机制已经明确。越来越多文献表明ncRNAs在这些过程中是不可或缺的，比如一种功能基因组方法显示数千种染色质基因间隔区信号指示转录的活化，这些信号基因被称为长链非编码RNAs。数据显示，大约有三分之一的lincRNA在人体细胞试验中表现出与染色质修饰复合物有关；小鼠胚胎干细胞表达的许多lincRNA可以控制细胞多能性和分化，这极有可能与染色质修饰复合物有关。此外，通过对人成纤维细胞染色质的RNA测序我们发现了许多内含子和基因间ncRNAs，这也进一步说明了lncRNAs可能参与染色质结构的调控。下面的例子主要描述了lncRNA是如何调控染色质结构的，而目前这一邻域的一个难点在于确定这些lncRNAs是如何协调修饰组氨酸的酶复合物与它自身之间的相互作用的（box1介绍了一些可能的模型）。NcRNA介导的染色质的调控并不仅仅依赖于PolII基因，Box2描述了一个关于RNA聚合酶I介导的基因转录的例子，其中ncRNA通过形成RNA/DNA三螺旋从而招募染色质修饰因子到特定的基因座。Box1：lncRNA介导的染色质修饰的可能机制1、顺式调节：在这个模型中，ncRNA是从控制染色质修饰的基因组相邻的位点转录得到的，ncRNA被转录后，可以限制染色质修饰复合物招募到基因组的特定区域。这种调控机制发生在反义转录物通过染色质修饰依赖性和RNA干扰非依赖性的途径控制有义转录物表达的系统内，这种机制与ANRIL的顺式调节有关。2、NcRNA介导的循环：从某一基因组位点转录的ncRNA可能与结合在同一染色体上的远端位点的染色质修饰复合物相互作用，从而建立了染色体内染色质结构修饰的循环。在这种模型中，组装的3D建模对于染色质修饰的控制至关重要。HOTTIPRNA就被认为具有这种建立循环的功能。3、三螺旋的形成：ncRNAs中的特异性序列可以与特定的DNA序列形成三螺旋结构，这可能会使染色质修饰复合物结合基因组位点上的ncRNA产生特异性。通过PolI调控转录的pRNA（box2会介绍）就被认为是以这种反式作用的。4、Tethering（捆绑机制?）：多种ncRNAs会与细胞提取物中的染色质修饰复合物发生免疫共沉淀，因此，ncRNAs可能为染色质修饰复合物之间的连接及其与DNA结合蛋白或转录因子（直接与染色质相互作用）提供link或者tether。5、变构激活或抑制活性：ncRNAs可能作为一种开关，通过复合物的构象变化来打开或关闭组氨酸尾的修饰，这种开关能够引起酶活性及DNA结合特异性的改变。HOTAIR（HOX反义基因间RNA）HOTAIR是最早被发现且最具特征的ncRNA，可以介导染色质结构改变及基因表达，它是由染色体12上的HOXC位点产生的一种2.2kb的非编码转录本。Hox基因包含调控动物身体分节发展的基因组。HOTAIR一开始表现出沉默人体细胞染色体2上的HOXD的转录的反式作用（见词汇表）。HOTAIR基因的敲除会导致转录增加、H3K27me3减少以及HOXD位点PcG（PolycombGroup）蛋白复合物2（PRC2）的占用减少。此外，HOTAIR会与PRC2的一个亚基（SUZ12）形成共免疫沉淀。这些结果显示HOTAIR是由HOXC位点转录的，通过一种未知的机制招募PRC2到HOXD位点并导致组蛋白H3的局部甲基化（H3K27me3）和转录沉默。但小鼠HOTAIR基因敲除却没有引起表达的改变或者HOXD位点的H3K27me3占用模式，这表明鼠的HOTAIR与人的功能不同（小鼠和人HOTAIR的序列及结构是非保守的）或者存在其他调控体内HOXD位点表观遗传状态和转录活性的机制。未来基于其他lncRNAs的小鼠基因敲除实验对于检验这类调控分子在体内的作用具有重要的意义（BOX3）。Box2：ncRNA介导的PolI转录调控在哺乳动物基因组中，rRNA存在于串联阵列中，它们中大多数都被异染色质和CpG甲基化所转录沉默并被标记了。这种沉默状态由NoRC维持，这是一种多亚基的染色质重塑复合物。NoRC与一种从rDNA启动子区域转录的ncRNA有关，这种ncRNA就是pRNA（promoter-associatedRNA）。消耗及过表达实验显示pRNA与NoPC的正确定位、rDNA的甲基化及防止PolI转录的染色质抑制状态有关。最近研究发现，小鼠细胞异位表达pRNA会触发从头甲基化，招募DNA转甲基酶基因DNMT3b及增加rDNA启动子处的异染色质组蛋白修饰（如H4K20me3和H3K27me3）。在pRNA中发现一特定序列，对rDNA启动子的靶DNA甲基化至关重要，而这段RNA序列与一种rDNA的启动子元件T0区序列是相似的。将生物素标记的包含T0区的pRNA变型被导入到细胞，再用链霉亲和素磁珠重新找回，就可以将内源性rDNA共纯化。体外实验表明，pRNA的T0区可以与rDNA的T0区形成三螺旋结构，相比双螺旋rDNA而言DNMT3b更加偏向于结合rDNA-pRNA三螺旋。这些结果说明pRNA的T0区与rDNA的启动子形成三螺旋从而招募了DNA的甲基转移酶基因，但DNA-RNA三螺旋是否就是一种ncRNAs用于靶向表观遗传改变的常用机制还有待确定。最近发现，HOTAIR作为RNA支架，能同时结合多种组蛋白调节酶，还能结合PCR2（pcG蛋白复合物2），还能与LSD1免疫共沉淀，LSD1是一种能使H3K4me2（组蛋白H3）去甲基化的酶，结合在HOXD区域。从图一a中看出，HOTAIR抑制转录是通过结合染色质到特定的基因区域来发挥作用的。HOTAIR作为支架同时结合PCR2和LSD1，使H3K27甲基化、H3K4去甲基化。在小鼠中敲出HOTAIR，增加了转录，减少了H3K27的表达和PCR2在HOXD位点的结合。基因组实验表明敲出HOTAIR导致PCR2和LSD1的消失，表明他们在表达上是相关联的。许多长链非编码RNA只有数个碱基的长度，能够和染色质修饰复合物结合，能够作为一个支架或平台去结合一些物质发挥协同功能，这可能为长链非编码RNA的广泛应用提供一个机制。HOTAIR在癌细胞转移中改变染色质的形态，在乳腺癌中HOTAIR的表达增加，它的表达与肿瘤的转移正相关，它的过度表达也会降低细胞的侵袭性。ANRIL（在INK4位点的反义非编码RNA）INK4b/ARF/INK4a基因在人类细胞中能够编码三种重要的肿瘤抑制物，消除或沉默一系列的癌基因。这些基因的表达受到PRC1，PRC2和甲基化组蛋白控制（如图1b）.ANRIL是一种长链非编码RNA，能够在一些肿瘤组织中发挥编码反义基因的作用，通过PRC1和PRC2亚基的相互作用来控制INK4b/ARF/INK4a基因的表观遗传学特征，结合PCR1和PCR2来抑制INK4b/ARF/INK4a基因的转录（如图1b）。致癌基因的表达抑制了ANRIL的表达，刺激了肿瘤抑制基因在INK4b/ARF/INK4a中的表达。HOTTIP(同源基因在远端的转录)图1c中说明同源基因是通过改变染色体结构来调节转录活性。HOTTIP在同源基因末端调节远程环路，通过结合组蛋白修饰物WDR5/MLL（该修饰物能够使H3K4甲基化）来活化转录基因。敲除HOTTIP后，人同源基因表达减少，说明HOTTIP参与了部分的转录激活。对高阶染色体结构分析也说明了，长链非编码RNA结合组蛋白修饰者对于基因表达的局部活化发挥作用。在别的长链非编码RNA中可能存在相似的机制控制转录。非编码RNA直接控制转录因子的聚集及其活性多种非编码RNA通过调节转录激活物的活性、辅助调节因子、通用转录机制来控制基因的表达，这些非编码RNA的作用机制和蛋白质靶点是不同的，它们能够作为蛋白质对接的支架，模仿DNA的功能，自我调节RNA聚合酶Ⅱ。Gas5（特异性生长抑制5）RNAGas5积累于生长停滞细胞中，通过阻遏糖