4种杀虫药剂对大型蚤(Daphniamagna)的毒性和酶活性影响的比较

北京大学学报（自然科学版），第33卷，第2期，1997年3月ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisPekinensis,Vol.33,No.2(Mar.1997)4种杀虫药剂对大型蚤（Daphniamagna)的毒性和酶活性影响的比较黎艳霞杨俭美（北京大学生命科学学院，北京，1008711）摘要利用生物毒性测试法与生化毒理测试法，分别探讨了4种杀虫药剂(7504、敌百虫、西维因、溴氰菊酯）对大型蚤幼蚤的毒性。其中溴氰菊酯的毒性最大，24hLC50为0.385μg/L；敌百虫次之，2.748μg/L；西维因为18.6μg/L;7504为303.7μg/L。在生物毒性测试的基础上选择不同浓度的杀虫药剂对大型蚤幼蚤进行培养，测其重要的酶系（乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶等）活性的变化。结果表明，不同的杀虫药剂对不同酶的酶活性有着不同程度的影响，并证明了生化毒理测试法较灵敏、精确。关键词大型蚤;杀虫药剂;酶活性中图分类号X13引言化学防治方法在害虫综合防治工作中，一直是很主要的方法，因此。农药的污染和残留问题是不可能完全避免的。为了加强环境质量管理，必须提高水体中农药残留的监测灵敏度。目前。水质监测的一个主要方法是生物监测。国际上公认的水生生物实验监测对象主要有鱼类和蚤类。鱼类的实验周期较长，实验难度较大，敏感度也不如蚤类，尤其是大型蚤，因此，从80年代以来。蚤类生物测试技术得到很大重视和发展。大型蚤是国际标准组织(ISO)公认的实验生物之一。但是，迄今为止，对大型蚤的毒性指标以传统的LC50与EC50为主，这种方法需要大量的实验材料和多次重复，而且灵敏度有一定的局限性，在低浓度(如非致死浓度LC0)时，无法进行毒性的比较。我们的实验发现杀虫药剂与家蝇（MuscadomesticaL．）、中蜂(Apiscer-anaSmith)和意蜂(ApismelliferaL．)的多种酶系如乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶等的活性有明显的相关性。本文以4种不同毒杀机制的杀虫药剂，对水生生物具有代表性的动物——大型蚤进行毒理实验（生物毒性指标为LC50。生化毒性指标为酶活性的抑制率和米氏常数Km值），以便提高监测水质中农药的灵敏度，为环境评价提供较为精确的依据。1材料与方法(1)实验动物：大型蚤(Daphniamagna)，取自预防医学科学院长期培养、通过鉴定的62D．M.大型蚤生物株。(2)刹虫药剂：7504(三氯杀虫酯)，中国科学院动物所经DDT改进而成，90%原粉；敌百虫(Trichlorphon)，900-/o原粉，抚顺有机化工厂；西维因(Sevin)，90%原粉，常州农药厂；溴氰菊酯(Deltamethrin，Decis)，98%原药，法国罗素优克福公司(Roussel-Uclaf)出品。以上4种农药的化学结构见图1。(3)小球藻培养法：温度，25℃，参照IS01982年推荐方法。(4)大型蚤培养：温度，(25±1)℃；光照，24h弱光；食物，小球藻；pH7.0左右；培养用水。ISO标准水。幼蚤选择，每24h选择一次,以保证个体整齐。(5)24hLC50的测试方法：参照ISO1982年的方法。取出生0～24h的幼蚤，在ISO标准水中洗3次，每次5min，实验中断食，24h后观察，记下死亡个体数并计算得LC50。(6)酶的活性及Km值测定：取出生0～24h的幼蚤，在含有不同浓度的杀虫药剂培养液中培养24h后。制得酶源。加入一定的底物经特定的温度和时间反应后，终止反应。根据分光光度计的测值计算出羧酸酯酶的活性及Km值、磷酸酯酶的活性、AChE的活性、谷胱甘肽-S-转移酶的活性。(a)三氯杀虫酯，有机氯类；(b)敌百虫，有机磷类；(c)百维因，氨基甲酸酯类；(d)溴氰菊酯，拟除虫菊酯类图14种杀虫药剂的结构Fig.1Thestructureoffourkindsofinsecticides2结果与分析2.1幼龄大型蚤对4种杀虫药剂的敏感度的比较用ISO规定的标准方法对出生0～24h的幼蚤进行测试，将大型蚤放在含有梯度浓度杀虫药剂的培养液中，接触培养24h后，观察死亡个体数，并计算出LC50(见表1)表14种杀虫药剂对幼龄大型蚤的毒性比较TahlelComparisonofthetoxicitvoffourkindsofinsecticidestoDaphniamagnia杀虫药剂类型毒力回归线方程rLC50/μg·L-1相对敏感度1）7504有机氯y=-0.238+2.110x0.988303.7788.8敌百虫有机磷y=4.027+2.216x0.9852.7487.14西维因氨基甲酸酯y=0.790+3.319x0.99518.648.31溴氰菊酯拟除虫菊酯y=5.276+0.665x0.9830.3851.001)相对敏感度：值越火，对杀虫药剂越不敏感，毒性越小。从表1可以看出，4种杀虫药剂对幼蚤的半数致死浓度(LC50)间的差异很大，其中，溴氰菊酯对大型蚤的毒性最大，其毒性为敌百虫的7.1倍、西维因的48.3倍、7504的788.8倍。毒性由高到低的顺序依次为：溴氰菊酯敌百虫西维因7504。根据修瑞琴对大型蚤的毒性分级标准。可知溴氰菊酯、敌百虫、西维因都属剧毒，7504属高毒。4种杀虫药剂使大型蚤中毒的速度不同：溴氰菊酯很快使大型蚤中毒（20min左右），敌百虫与西维因较慢，7504使大型蚤中毒的速度最慢。中毒症状基本相似，首先，运动失常，在水中快速转动，而后稍息片刻，继续转动，最后沉入水底，直至死亡。2.24种杀虫药剂对大型蚤羧酸酯酶的影响根据以上实验结果，分别对4种杀虫药剂选择两个浓度的药液(全部致活浓度LC0和半数致死浓度LC50)，对0～24h的幼蚤进行培养，培养24h后。用ISO标准水冲洗3次，分别测定酶的活性与酶的特征常数(Km)。每个浓度的实验幼蚤为60头，表中数据为平均值。表24种杀虫药剂对大型蚤羧酸酯酶的影响Table2TheeffectoffourkindsofinsecticidestoDaphniamagna'scarboxylesterase农药种类LC0LC50酶活性抑制率比活力抑制率Km值酶活性抑制率比活力抑制率Km值75045.71）0.91）1.0633.62）28.22）1.80敌百虫13.62）9.02）1.2923.61）29.11）1.67西维因23.12）9.72）1.1544.82）52.22）2.02溴氰菊酯10.52）41.92）2.1450.32）73.02）2.95t检验:1）有差异（0.05P0.01）；2)有明显的差异(P0.01）。4种杀虫药剂对大型蚤羧酸酯酶的酶活性与比活力都有抑制作用，并且随着浓度的增加，抑制作用增强。4种杀虫药剂都使羧酸酯酶Km增大，说明杀虫药剂影响了大型蚤的羧酸酯酶与a-NA底物的亲和力。浓度为LC50的4种杀虫药剂对大型蚤羧酸酯酶的酶活性抑制率为溴氰菊酯敌百虫7504西维因。2.34种杀虫药剂对大型蚤磷酸酯酶的影响2.3.1酸性磷酸酯酶用这种方法检测不出大型蚤酸性磷酸酯酶的酶活性，可能是由于大型蚤的酸性磷酸酯酶的含量很小的缘故。2.3.2碱性磷酸酯酶4种杀虫药剂对大型蚤碱性磷酸酯酶的影响见表3。从表3可以看出，浓度为LC0的7504、溴氰菊酯、西维因对大型蚤碱性磷酸酯酶的酶活性和比活力的影响不明显，而浓度为LC0的敌百虫对碱性磷酸酯酶的酶活性和比活力都有抑制作用。浓度为LC50的4种杀虫药剂对大型蚤碱性磷酸酯酶的酶活性和比活力都有抑制作用，抑制作用的大小为敌百虫西维因溴氰菊酯7504。表34种杀虫药剂对大型蚤碱性磷酸酯酶的影响农药种类LC0LC50酶活性抑制率比活力抑制率酶活性抑制率比活力抑制率75049.91）0.831）25.02）27.82）敌百虫8.81）6.61）33.02）23.62）西维因20.82）26.12）34.82）40.23）溴氰菊酯1.21）5.011）27.62）19.72）t检验；1）无差异(P0.05)；2)有差异(0.05P0.01)；3）有明显的差异(P0.01)。2.44种杀虫药剂对大型蚤胆碱酯酶的影响用这种方法检测不出正常的大型蚤胆碱酯酶活性。2.54种杀虫药剂对大型蚤的谷胱甘肽-S-专移酶(GST)的影响4种杀虫药剂对大型蚤GST的影响见表4。从表4可以看出，4种杀虫药剂的浓度为LC0时，对大型蚤GST的酶活性和比活力都无影响，当浓度升高到LC50时，西维因、敌百虫对GST无影响，但7504和溴氰菊酯对GST的酶活性和比活力都有抑制作用．并且后者作用较强。表44种杀虫药剂对大型蚤的GST的影响Tahle4TheeffectoffourkindsofinsecticidestoDaphniamagna'sGST农药种类LC0LC50酶活性抑制率比活力抑制率酶活性抑制率比活力抑制率75041.61）2.71）11.52）9.32）敌百虫4.31）—4.01）01）1.31）西维因—1.31）—4.01）2.71）—5.31）溴氰菊酯8.81）4.01）16.13）18.73）t检验；1）无差异(P0.05)；2)有差异(0.05P0.01)；3）有明显的差异(P0.01)。3讨论3.14种杀虫药剂对大型蚤的毒性有显著差异从本实验对62D.M．大型蚤生物株生物测定所得LC50的结果可以看出：溴氰菊酯和7504对大型蚤的毒性相差约800倍。这两种杀虫药剂从结构上分别属于拟除虫菊酯类和有机氯类。但它们的杀虫机制极为相似，都是影响或抑制神经轴突传导，但由于溴氰菊酯的结构上有CN基，能使轴突膜上Na+通道打开后长期不关闭，就使得负后电位加强，产生重复后放；而7504使Na+通道延迟关闭，因此，溴氰菊酯和7504对大型蚤毒性的显著差别不仅是由于结构上的不同，毒杀机制的略有差异也是一个原因。敌百虫和西维因虽然都属于胆碱酯酶的抑制剂，破坏和阻碍神经传导，但它们的结构与活性完全不同，前者属于有机磷。后者属于氨基甲酸酯。二者的防治对象和应用范围也不同，因此它们对大型蚤的毒性有显著差异。综上所述。这4种杀虫药剂对大型蚤都有很大的毒性。为了保护水环境，防止水域或水源的农药污染，利用大型蚤作为指示生物是比较可靠的。3.24种杀虫药剂与大型蚤几种酶的酶活性之间的关系当分别用4种杀虫药剂LC50的浓度培养大型蚤后，对其几种酶活性抑制率的变化进行比较，其敏感性的顺序为：7504，羧酸酯酶碱性磷酸酯酶谷胱甘肽-S-转移酶；敌百虫，羧酸酯酶碱性磷酸酯酶谷胱甘肽-S-转移酶”；西维因。碱性磷酸酯酶羧酸酯酶谷胱甘肽-S-转移酶1)；溴氰菊酯，羧酸酯酶碱性磷酸酯酶谷胱甘肽-s-转移酶。本卖验结果初步证明溴氰菊酯、7504、敌百虫、西维因对大型蚤的羧酸酯酶和碱性磷酸酯酶都有较大的抑制作用；溴氰菊酯、7504对大型蚤的谷胱甘肽-S-车专移酶也有一定的抑制作用，而敌百虫、西维因对大型蚤的谷胱甘肽-S-车专移酶无影响。唐振华等发现对有机磷产生抗性的淡色库蚊涉及的水解酶主要为羧酸酯酶与酸性磷酸酯酶：杨俭美等用半致死剂量的杀虫药剂处理意蜂，发现处理后的意蜂谷胱甘肽-S-转移酶活性无变化。本实验用的大型蚤是一敏感的纯系生物株，敌百虫与西维因主要抑制它的羧酸酯酶和碱性磷酸酯酶，对谷胱甘肽-S_转移酶几乎无影响，这与对昆虫的作用很相似。以大型蚤为实验对象来研究杀虫药剂与酶活性的关系，尚属首此。从表2～表4可以看出，酶活性的变化与比活力的变化不成比例，说明了杀虫药剂对酶的影响是极其复杂的。还有待于进一步探讨。从表2可以看出，即使杀虫药剂的浓度在不足以使大型蚤死亡的低浓度时。用传统的LC50方法是不可能测出杀虫药剂对大型蚤的毒性影响，而用生化毒理法能明显地看出杀虫药剂对大型蚤酶活性和Km值的影响。因此我们认为。用生化方法对大型蚤的毒性测定，比传统的生物学方法具有较多优越性。它不仅快速、简便。而且能准确、灵敏地对水环境中的轻度污染进行早期预测，从而能达到及时采取有效措施、加强管理和保护水