5第五章细菌的遗传分析

第五章细菌的遗传分析教学基本要求：1．熟练掌握细菌遗传分析的有关内容，如细菌的杂交；Ｆ因子；高频重组；用中断杂交技术作连锁图；大肠杆菌的染色体呈环形；F因子整合到细菌染色体的过程；细菌的交换过程；重组作图；性导；三种不同的致育因子的相互关系。2．理解转化与转导作图的原理，学会实验数据的分析方法。学时数：4学时第一节细菌的细胞和染色体原核细胞与真核细胞的区别：1、原核细胞没有核膜，也没有细胞核，只有染色体区，称拟核区；真核细胞具有细胞核，染色体与细胞质分开。2、原核细胞的染色体是一条裸露的DNA分子，DNA含量校真核细胞少得多，较易插入DNA片断。3、原核细胞没有线粒体、质体等细胞器。4、转录和翻译无论在时间上还是空间上都难以分开。5、原核细胞一经分裂就相互分离，呈单细胞状态。20分钟一代。共同性:遗传物质都是核酸，传递信息的密码子是相同的。原核细胞如细菌、藻类、支原体。第二节大肠杆菌的突变型及筛选一、营养缺陷型在营养代谢上是有缺陷的，统称为营养缺陷型，而把正常的野生型叫做原养型。原养型细菌对培养基中的营养成分要求很简单，只要求有葡萄糖和一些无机盐就能生活。这种能保证野生型生活的最低限度的培养基叫做基本培养基。而营养缺陷型由于基因空突变，丧失了自己制造某种物质（氨基酸，维生素。嘌呤或嘧啶等）的能力，所以在营养代谢上产生了特殊的要求，只有在基本培养基中补加了它们所不能合成的某些物质，才能使营养缺陷型正常生长。这种补加了一定营养物质的基本培养基叫做补充培养基（additivemedium）。完全培养基。1、合成代谢缺陷型：不能合成细菌生长所需要的物质。(1)鉴别：(2)基因型的表示：用它们不能合成的物质的前三个字母来表示印迹法（印章法）简介2、分解代谢缺陷型：如不能发酵乳糖，阿拉伯糖，甘露糖，木糖，麦芽糖。(1)鉴别：如鉴别乳糖发酵缺陷型，在培养基上加伊红和美蓝这两种染料（EMB培养基），原养型菌落是红色，缺陷型为白色菌落。选择培养基：能把野生型和突变型明显地区别开来，使人们进行选择的培养基。(2)基因型表示lac-乳糖不能利用。gal-半乳糖不能利用。二、抗药型（resistant）野生型细菌通常会被一定剂量的某种药物杀死，所以叫做药物敏感型（sensitive）。1、鉴别：在培养基中加入相应的药物，如青霉素，链霉素。2、抗药机理：敏感型细菌核糖体30S亚基的S12蛋白和链霉素结合，使翻译发生差错，或使翻译过程的启动作用失效。而抗药型S12变异，不不再和链霉素结合。青霉素抑制细胞壁的形成。3、基因型的表示：用该药物名称的前三个字母名称并在右上角附加r表示抗药型，s表示敏感型。如PensPenr青霉素strsstrr链霉素azirazis叠氮化钠注意：敏感型是野生型三、抗噬菌体突变型1、原理：野生型细胞壁上有噬菌体的接受点（phagereceptorstops）;而抗噬菌体突变型没有噬菌体的接受点。2、鉴别：噬菌斑。3、基因型表示：对T1噬菌体抗性变突体Tonr或ton，敏感型Tons或ton+，同理T2噬菌体，Ttos，Ttor。4、噬菌体与细菌的关系——侵染与抗性第三节大肠杆菌的性别细菌的有性生殖（杂交）最初是在大肠杆菌中发现的。一、经典的杂交试验Lederberg和Tatum（1046）用大肠杆菌K12的两个菌株A和B的杂交试验：A、B混合培养在完全培养基上过夜，然后离心培养物，把沉淀细胞涂布在基本培养基外，发现长出了菌落，频率10-7（在果蝇中是办不到的）出现了基因重组证实：Davis（1950）U型管试验。两个菌株不能直接接触，只能是培养液和营养物质可以通过。因此，可以说，菌株A、B接触后，象高等的有性过程一样，发生了杂交。遗传物质有了交换，产生了新组合：野生型重组体。但是，LederbergTatum解释：步骤(1)细胞融合（同宗配合）；(2)形成二倍体合子；(3)交换－减数分裂存在问题：两个亲本类型对它们的子裔的遗传贡献并不相同。有些基因组合丢失——与典型的减数分裂不同。本质的认识是从Hayes的一个意外的发现才逐渐清楚，Hayes证明大肠杆菌有性过程是异宗配合。二、遗传物质的单方向转移Hayes实验1：菌株Amet-thr+leu+thi+菌株Bmet+thr-leu-thi-str处理A+未处理B——→存活有重组（与对照频率一样）基本培养基str处理B+未处理A——→无存活Hayes解释：(1)str处理后，不能繁殖，只有另一方繁殖。(2)如果转移是双向的，两种杂交都全出现重组型，供体经链霉素处理后，不能分裂，但仍能转移基因，而受体未受处理，仍能分裂。所以接受转移过来的基因后，有可能在基本培养基上形成菌落。所以，大肠杆菌中遗传物质的交换不是交互的。事实上，菌株B作为遗传物质的受体，菌株A作为供体。三、F质粒（F因子）的发现1、Hayes实验2：Hayes偶然发现了A菌株的一个不育的突变型，具有下面的遗传特性：可育Hayes的解释：大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子（fertilityfactor）或性因子（sexfactor）决定的——F因子，具有这种因子的能育品系记为F＋，相当于雄性。不含这种致育因子F的品系记为F－，相当于雌性。F+细菌的表面有称作性伞毛（sexpili）的细长细毛，由此与F－细菌接合，一旦接触后，伞毛发生改变，成为两细胞间的原生质通道——细胞质桥或称结合管（conjugationtube），F+细胞的F因子通过接合管向F－细胞转递：使F－变成F＋，F因子还可改变细胞表面的构造，以防F＋细胞间的接合。2、F质粒：F因子就是F质粒。质粒：是指染色体外的遗传物质。可以自主复制，并在细胞分裂时分配到子细胞中。特性：(1)自主复制(2)感染感染性质粒。F质粒是能独立增殖的环状DNA分子。图示。F质粒的结构：(1)原点，转移的起点(2)致育基因：形成性伞毛的基因群(3)DNA复制酶基因(4)插入序列（配对区域）（insertionsequence，IS）3、F质粒转移的过程：F+×F-的过程图示：滚环式复制，σ式。4、F+×F－的特点：(1)F质粒转移的频率高，1/10，使F-→F+。(2)而染色体转移频率低。10-7。(3)F+×F+不发生接合。因此，F+品系又称为低频重组品系（lowfrequencyrecombination）四、高频重组品系HfrCavalli（1951）和Hayes（1954）先后从能育的A品系中分离出两个新的品系，它们和B（F-）杂交，出现重组频率很高。比AF+×BF-高出1000倍。这种品系称为高频重组品系Hfr（highfrequencyrecombination）。1、Hfr的特点：(1)高频重组，染色体转移频率高，×1000(2)F质粒转移频率低F－→F＋很少或没有。2、Hfr的形成及转移过程图示：配对→整合→接合→接合管→σ复制→转移起点。3、Hfr和F+的联系和区别联系：（1）都是雄性菌，含有F质粒（2）整合游离区别：（1）前者高频重组，后者低频重组；（2）前者F质粒转移频率低，后者F质粒转移频率高；（3）前者F质粒整合，后者F质粒游离4、附加体的概念，频率高的原因可见，不同的基因进入受体细胞时间是不同的。位于前端的基因，首先进入，可以想象，基因间的距离越长，转移的时间间隔越长，因此，可以用基因转移的时间长短、顺序来表示基因在染色体上的图距—即时间作图法。这要用中断杂交技术。第四节中断杂交与重组作图一、中断杂交实验原理与作图Wollman和Jacob想了解Hfr品系在杂交时，什么时候把基因转移给F－细菌，他们把两个品系进行杂交Hfr：thr+leu+azirtonrlac+gal+strs×F-：thr-leu-azistonslac-gal-strr问题1：如何确定基因转移的顺序和时间?混合培养液进行通气培养，每隔一定时间取样，把菌液放入搅拌器内搅动以打断配对的接合管，使接合的细胞分开以中断杂交然后检查某一基因是否发生重组。问题2：如何检出某一基因的重组子?把中断杂交的细菌放在完全培养基上培养，显然供体、受体菌都能生长。影响检别，我们只需要把发生重组的重组子检出。这就必须有一个可供选择用的供体标记基因。这样可以认出重组子，如在基本培养基中培养选择thr+leu+重组子。这时thr+leu+为标记基因，可排除受体菌株，但供体菌还能继续存在。为了不选择供体细胞本身，供体细菌也应该带有一个特殊的标记，能使自己不被选择。例如供体菌对链霉素敏感，这样当结合体在含有链霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。因此，把中断杂交的细菌稀释接种到含有链霉素的基本培养基上，如能形成菌落，它的基因型必定是thr+leu+strr。因为只有这种重组子才能生长。并说明供体thr+和leu+已进入受体并发生重组。我们称在供体菌中被选择的基因thr+和leu+为选择标记，而始终不被选择的strs为反选择标记基因，而那些还没有进行选择检定的基因为非选择标记。问题3：在发生重组的菌落中，如何检别非选择标记基因。对每一时刻的重组thr+leu+strr的菌落影印培养接种到不同的培养基上（如乳糖lae++伊红→红，gal++美兰→红色）。记录重组子中每一非选择标记出现的时间、出现的频率和持续时间，得右图（Hfr的非选择标记基因进入F-所需的时间，以及根据非选择标记在各个时间出现的频率作图）。从图中可以看到，从Hfr菌株的基因在F-细菌中出现的开始，随着时间的增加，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某一频率为止。而且某一基因出现的时间愈早，它达到的频率愈高。解释：因为基因在染色体上，从染色体的一端开始，以线性方式按一定的时间顺序依次进入F-细胞，始端称为原点（origin）或0。显然，基因离开原点越远，进入F-细胞越迟。离开原点较远的基因，可能在转移过程停止以前，仍未转移，因而频率较低，达到的最高值也较小。根据以上实验，如果以转移的时间单位（每分钟）作为基因间的距离单位，就可以作出Hfr染色体上的基因分布图。如果杂交持续2小时，然后中断交配，就会发现一些细胞转变为Hfr。这说明致育因子是最后转移到受体，是染色体的最后单位。所以频率很低。中断杂交技术（interruptedmatingtechnique）：根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。二、环状的染色体Wollman和Jacob用不同的Hfr品系进行了大量的中断杂交试验，并作出了基因的连锁图。表Wollman和Jocob提出假设：大肠杆菌的染色体是环状的。这是由于F因子插入环形染色体的不同位置以及配对方向不同而引起的（插入序列IS有极性）图示，因而有不同的转移起点和方向。三、细菌重组的特点转移到受体中的染色体必须通过交换过程整合到受体的基因组中去。重组的特点:1、形成部分二倍体（partialdiploid）或部分合子（merozygote）2、只有偶数次交换才能产生平衡的重组子。3、相反的重组子不会出现。图示：(1)单交换产生不平衡的线性染色体。(2)双交换产生有活性的重组子和片段，片段以后在细胞分裂中失去，所以重组子不会出现。四、重组作图的原理和方法在中断杂交中，根据基因转移的先后次序，以时间为单位求出各基因间的距离，叫做时间作图法。如果基因间转移的时间在两分钟以内，用这种方法求得的基因间距离就不很精确可靠，重组作图是根据基因间重组率进行定位的。接合重组作图的特点：（与减数分裂生物的区别）(1)不用亲本类型(i)无法区分，(ii)不重组将丢失。(2)两对基因间的交换频率，必须在形成部分二倍体的条件下，计算重组率。(3)部分二倍体如果不发生重组，无法鉴别。只有最后一个基因进入受体细胞，长并发生重组才能鉴别，即最后一个基因发生重组的条件下，计算两基因的重组率。(4)接合重组不产生相反的重组类型。例如根据中断杂交试验知lac和ade基因是紧密连锁的而且lac比ade先进入受体。试验：Hfrlac+ade+strs×F-lae-ade-strr混合60分，链霉素基本培养基。未杂交的被杀死。选出来的都是ade+