8.3PCR技术的应用

PCR技术的应用一.聚合酶链式反应（英文全称：PolymeraseChainReaction）聚合酶链式反应简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。8.3.1聚合酶链反应的原理和操作（一）工作原理PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成的DNA合成。（二）PCR的基本操作PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①变性，通过加热使模板DNA完全变成单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；②退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；③延伸，将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新生DNA链延伸。1.模板DNA的变性，双链DNA的变性温度由其G+C含量来决定，模板DNA的G+C含量越高，熔解温度也越高。一般来说，模板DNA经加热至94℃左右一定时后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。2.模板DNA与引物的退火(复性)：退火是引物和模板DNA复性。复性过程采取的温度（Ta）至关重要。复性温度过高，引物不能和模板很好地复性，扩增效率很低。通常，模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。3.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TapDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可PCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定、DNA聚合酶、dNTP、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR扩增仪所需的循环数取决于反应系统中的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。所以反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)×n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。8.3.2PCR反应条件（一）PCR的基本成分（二）PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数1.①温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。②退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。③延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60核苷酸/S/酶分子55℃24核苷酸/S/酶分子高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。④PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min.延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。2.循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。8.3.3TapDNA聚合酶和PCR扩增的精确性具有以下特性（一）酶活性和热稳定性（二）离子依赖性（三）忠实性8.3.4PCR模板基因组DNA质粒DNA噬菌体DNA预先扩增的DNAcDNA和mRNA等几乎所以形式的DNA和RNA都可以作为PCR反应的模板。8.3.5PCR引物引物是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。一般来说，引物越长，对靶序列的特异性也越更高。引物就是为了增幅目的DNA而导入的短小DNA片断，在PCR反应中，新合成的DNA是要接在引物上才能继续按照模版DNA复制。引物的设计因需要增幅的序列而不同。8.3.6PCR技术在食品检测中的应用1.PCR技术在食品微生物检测中的应用PCR技术检测微生物的基本原理是在被检测微生物核酸序列,在PCR体系下经高温变性、低温退火、适温延伸三步循环将单个核酸分子序列以2的指数进行大量复制扩增的过程。即在检测时,被检测微生物双链DNA序列在94℃变性解链成双链,55℃特异性引物与单链DNA结合,72℃在引物的引导延伸复制检测微生物DNA序列。以上三步进行循环扩增得到大量的被检测微生物DNA序列,最后一般在凝胶电泳下检测目的DNA。理论上只要样品中有一个分子的微生物就可以在短时间内用PCR技术检测到。食品中污染微生物种类很多,即使是同一种食品中微生物种类也有很多,用传统的方法检测食品中微生物要分离出所有的微生物很困难。特别是在检测食品中的弱势菌时,可能很难用传统的方法检测出来,特别是有些微生物很难培养,而用PCR技术检测这些微生物可以避免这些问题,因此,利用PCR技术能够比较准确地检测食品中微生物。2.PCR技术在食品致病菌检测中的应用传统方法检测食品中致病菌的步骤繁琐费时，需经富集培养、分离培养、形态特征观察、牛理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程，并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。而应用PCR技术，只需数小时，就可以电泳法检测出0．1mgDNA中仅含数个拷贝的模板序列；用PCR扩增细菌中保守的rDNA片，还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。利用PCR检测食品中的致病菌，首先要富集细菌细胞，通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞，然后裂解细胞，使细胞中的DNA释放，纯化后经PCR扩增细胞靶DNA的特异性序列，最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的DNA序列。2．1检测沙门氏菌沙门氏菌(Salmonella)是公共卫生学上有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠杆菌科，蛋、家畜和肉制品是主要传播媒介。传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生长化及血清学鉴定很费力、耗时，需4～7h才能完成，其他如抗体检测法，虽然快速，但其高假阳性使之不适于常规检测。此外，低水平的病原菌污染，食品加工后导致沙门氏菌的“致伤”及食品其他成分的干扰等因素，使得沙门氏菌的检测受到一些限制。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。分子生物学技术的发展，使得许多食品微生物学者寻求如PCR技术来检测病原菌，以期增加敏感性和显著地减少检测时问。PCR技术检测沙门氏菌的特异性，取决于所选择的扩增靶序列是否为沙门氏菌高度保守的特异性片断，能否忠实地扩增靶序列，由人工合成的一对寡核苷酸引物序列决定。反之，引物设计又取决于沙门菌是否具有显著特征的属或种特异性靶序列，显然靶序列的选择和引物的设计是试验成功与否的关键。据目前报导设计的引物来看，基本上是根据沙门氏菌的一段已知序列设计的，并且大多数是根据属特异靶序列设计的。近年来，用PCR技术检测沙门氏菌得到了迅速发展，产生了许多种PCR法。如常规PCR、套式PCR、多重PCR。也可几种方法结合使用，将常规PCR与半套式PCR相结合，根据沙门氏菌中保守的16SrRNA基因为模板设计了一对引物，扩增的片段为555bp。经过优化设计反应条件，只对沙门氏菌产生特异扩增，敏感性达30cfu。