8人参藜芦合用对大鼠肝P450酶活性及mRNA表达的调控作用040930

第1页共6页KSBIO-NO.0404《中国中药杂志》367页人參、藜蘆合用對大鼠肝P450酶活性及mRNA表達的調控作用王宇光，高月*，柴彪新，陈鹏，谭洪玲，赵永红，肖成荣，孙圆媛，朱力军(军事医学科学院放射医学研究所药理毒理研究室，北京100850)[摘要]目的：研究中药十八反中人参与藜芦合用对P450同工酶在酶活性及mRNA水平的调控作用。方法：采用紫外分光光度法测定大鼠肝微粒体细胞色素P450与细胞色素b5含量及氨基比林N-脱甲基酶(APND)、对硝基苯酚羟化酶(pNPH)活性。采用RT-PCR技术检测大鼠肝中5种P450同工酶CYPlAl，CYP2B1/2,CYP2C11，CYP2El及CYP3A1mRNA的表达。结果：人参与藜芦合用可明显降低P450蛋白含量，可降低细胞色素b5的含量，单药及其与藜芦配伍都能使APND活性下降。在mRNA水平上，藜芦可诱导CYP2C11的基因表达，与人参合用后却使得CYP2C11的表达下降。藜芦与人参配伍诱导了CYPlAl的表达。人参可抑制CYP2B1/2的基因表达，与藜芦合用后却明显诱导了CYP2B1/2的表达，人参与藜芦合用后也明显诱导了CYP3A1的表达。结论：人参与藜芦配伍前后对一些CYP亚型调控作用发生明显变化，可能存在基于药物代谢酶机理的相反作用，需进一步结合代谢研究加以综合分析，阐明相反作用的机理。[关键词]十八反；细胞色素P450；逆转录聚合酶链式反应；药物相互作用[中图分类号]R285.5[文献标识码]A[文章编号]1001-5302(2004)04—0366-05细胞色素P450(cytochromeP450)氧化酶系统是对许多内源性和外源性物质进行I相氧化代谢的主要酶类[1]，其主要位于肝脏中。许多外源性物质包括治疗药物、环境化合物及一些天然产物都能对细胞色素P450酶系统产生诱导或抑制效应，这种对于细胞色素P450催化的氧化反应的调控作用可以改变许多化合物的药理或毒理活性[2]。中药十八反是中药药性理论的重要组成部分，是中药七情“相反”这一配伍的具体体现[3]。人参与藜芦属中药十八反中相反药对，属中药配伍禁忌。反的作用主要是指两种中药配伍应用产生毒性或使药效降低。近年来研究发现，很多中草药如葛根[4]、栀子[5]、甘草[6]、黄芩[7]等及其单体化合物黄芩苷、栀子苷、甘草甜素都对P450酶有调控作用，说明中药对P450酶作用是一种客观存在。研究人参与藜芦配伍应用对主要的药物代谢相关的CYP同工酶的酶活性及mRNA表达的影响，为进一步探讨十八反作用的机理及可能产生的药物相互作用提供实验依据。1材料与方法1.1药品与试剂人参购自北京同仁堂中药厂，藜芦购自河北安国中药材市场，均经本所马百平教授鉴定分别为五加科植物人参PanaxgingsengCAMey.的干燥根；百合科植物黑藜芦VeratrumnigrumL.的干燥根。人参称重后加入10倍量水，浸泡90min后煎煮3次，每次1h，提取液合并，旋转蒸发浓缩药物浓度为100g·L-1；藜芦水煎液制备同上，药物浓度为10g·L-l；人参-藜芦混合煎液按《中国药典》I部规定的临床剂量比例称重混合，制备方法同上，药物浓度为100g·L-1。Folin酚试剂为sigma公司产品；氨基比林(aminopyrine)为北京化学试剂公司产品；对硝基苯酚(p-nitropheno1)为北京理工大学宏宇化工公司产品；RNA提取试剂盒(RNAgentsTotalRANisolationsystem)为promega公司产品；逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptase-polymerasechainreaction，RT-PCR)试剂盒，DL2000第2页共6页DNAMarker为takara公司产品。CYPlAl，CYP2B1/2，CYP2C11，CYP2C11andCYP3A1及内参照亲环蛋白(cyclophilinCYC)的引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。其他无机及有机试剂均为分析纯。1.2动物分组及给药Wistar大鼠，体重180~230g，♀♂各半，由军事医学科学院实验动物中心提供。随机分为空白组、藜芦组(0.075g·kg-1)、人参组(0.75g·kg-1)、人参藜芦组(0.83g·kg-1)，每组8只，其中空白组用生理盐水，各药物组给予规定剂量，连续灌胃给药7d后处死动物，取肝脏制备微粒体和RNA。1.3肝微粒体的制备大鼠脱臼处死，打开腹腔和胸腔，剪开心脏用注射器吸生理盐水以门静脉灌洗至肝脏颜色变为土黄色。采用钙沉淀法制备微粒体，肝脏按1：4(W/V)比例加入TMS缓冲液匀浆后于4℃，10360r·min-1，离心20min，取上清液与85mmol·L-1CaCl2混匀冰浴5min，4℃，15540r·min-1，20min离心后，沉淀用0.1mol·L-1Tris-HCl缓冲液(含150mmol·L-lKCl)重悬，再进行4℃，15540r·min-1，20min离心，沉淀用0.01mol·L-1Tris-HCl缓冲液(含1mmol·L-1EDTA)的20％甘油重悬，放入液氮中保存备用。微粒体蛋白浓度采用lowery法定量[8]，使用牛血清蛋白作为标准。1.4药物代谢酶的酶活性测定细胞色素P450与b5含量测定采用Omura和Sato的方法测定[9]。氨基比林N-脱甲基酶活性(APND)[10]，对硝基苯酚羟化酶(pNPH)活性测定按文献[11]方法进行。1.5肝组织总RNA提取大鼠处死后迅速取出肝脏，置于液氮中保存。按promega公司RNA提取试剂盒说明书提取肝脏总RNA。电泳分析表明18S和28S条带清晰可见，A260/A280比值在1.7~1.9，总RNA片段完整未降解，可用。1.6逆转录(RT)反应取总RNA2μg，分别加入MgCl28μL，10×PCRbuffer4μL，dNTPmixture4μL，RNaseInhibitor1μL，AMVReverseTransciptase2μL，oligodT2μL，加RNase-freeH2O至终体积为40μL并混匀。反转录的条件为42℃，30min，99℃，5min，5℃5min后进行扩增反应或在-20℃保存待用。1.7扩增(PCR)反应并测定mRNA表达水平取上述逆转录产物5μL，加入MgCl21.5μL，10×PCRbuffer2μL，Taq酶0.125μL，特异性引物正义链和反义链各3μL，RNase-freeH2O14.325μL，使反应终体积为25μL。用以下条件进行PCR反应：起始变性94℃，30min；循环时94℃，30s，56℃，1min，72℃，1min，进行23轮循环最后延伸72℃，8min，将CYPlAl，CYP2B1/2，CYP2C11，CYP2E1，CYP3A1及CYC(管家基因，作为内参照)等体积的PCR扩增产物10μL上样，经1.5％琼脂糖凝胶电泳辨认，拍照，检测时以CYC基因的RT-PCR产物为内参照，计算CYPlAl，CYP2B1/2，CYP2Cll，CYP2E1及CYP3A12基因与CYC基因扩增条带表达量像素灰度的比值作为P450亚酶mRNA表达的相对水平。特异性引物序列见表1。表1用于半定量反转录聚合酶链反应分析的大鼠P450亚酶引物序列P450同工酶5‘正义链引物3‘反义链引物片段长度/bpCYP1A1CTGGTTCTGGATACCCAGCTGCCTAGGGTTGGTTACCAGG331第3页共6页CYP2B1/2GAGTTCTTCTCTGGGTTCTGACTGTGGGTCATGGAGAGCTG549CYP2C11CTGCTGCTGCTGAAACACGTGGGATGACAGCGTACTATCAC248CYP2E1CTCCTCGTCATATCCATCTGGCAGCCAATCAGAAATGTGG473CYP3A1ATCCGATATGGAGATCACGAAGAAGTCCTTGTCTGC579CYCCTTCGACATCACGGCTGATGGCAGGACCTGTATGCTTCAGG2651.8数据统计实验数据用x±s表示，采用SAS软件两因素析因设计的方差分析进行组间比较。2结果2.1单药及配伍应用对大鼠肝细胞色素P450及细胞色素b5含量的影响表2可见，在临床用药剂量并且连续给药7d后，藜芦组P450含量与对照组比较无显著性差异(P0.05)，人参组与对照组比较P450含量明显下降(P0.05或P0.01)，表现出对P450酶整体上的抑制作用。与藜芦配伍合用后使P450酶含量下降，与对照组、藜芦组比较均有显著性差异(P0.05或P0.01)。在对细胞色素b5的影响可以看出，藜芦组与人参组两个单药组对细胞色素b5含量均无明显影响，与对照组比较虽有下降，但统计学上无显著性差异(P0.05)，而与藜芦配伍后使细胞色素b5含量均明显下降。藜芦-人参组与对照组、藜芦组比较有显著性差异(P0.05)。表2人参及其与藜芦配伍对大鼠肝细胞色素P450含量和b5含量的影响（x±s，n=8）组别剂量/g·kg-1P450/nmol·mg-1b5/nmol·mg-1空白对照00.65±0.280.35±0.25藜芦0.0750.55±0.290.38±0.26人参0.7540.32±0.161，3）0.17±0.06人参+藜芦0.8290.29±0.212，3）0.15±0.081，3）注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.01；与藜芦组比较3）P0.052.2单药及配伍应用对大鼠APND活性的影响由图1可见，无论单药组还是配伍组，与对照组比较都表现出一定的对APND活性的抑制作用。人参组、藜芦—人参组与对照组比较有非常显著性差异(P0.01)。在构成相反对的两中药同时服用时，藜芦-人参组与藜芦组比较有显著性差异(P0.01)且为抑制作用。2.3单药及配伍应用对大鼠pNPH活性的影响由图2可见，单药中藜芦组对pNPH活性影响不大，基本上与空白组酶活性第4页共6页相同。人参组对pNPH活性有一定的抑制作用，与空白组比较有显著性差异(P0.05)。藜芦—人参配伍组对此酶产生了抑制作用，与空白组和藜芦组比较有显著性差异(P0.05)。2.4细胞色素P450酶亚型在大鼠肝微粒体中表达利用RT-PCR从4个不同的处理组扩增5种CYP同工酶PCR产物凝胶电泳结果见图3。统计结果见表3，在对CYP2C11mRNA的调控作用中，单药组中藜芦可显著诱导CYP2C11mRNA的表达，与对照组比较有极显著差异(P0.001)，人参组对CYP2C11表达无明显影响(P0.05)。配伍组中CYP2C11表达与空白组比较无显著性差异(P0.05)，但与单用藜芦时可明显诱导CYP2C11mRNA不同，配伍组CYP2C11的基因表达明显低于藜芦组(P0.001)。表3人参及其与藜芦配伍对大鼠肝脏P450亚酶mRNA表达水平的影响（x±s，n=3）组别CYP/CYC比值CYP2C11/CYCCYP1A1/CYCCYP2E1/CYCCYP2B/CYCCYP3A1/CYC空白组0.70±0.1003.14±0.851.96±0.634.37±2.81藜芦组1.27±0.042)04.23±0.101.01±0.113.11±0.18人参组0.78±0.0503.47±1.220.61±0.191)1.96±0.01藜芦+人参组0.77±0.073)0.10±0.184.45±1.271.87±0.113,5)5.54±1.614)注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.001；与藜芦组比较3）P0.001；与人参组比较4）P0.05，5）P0.001CYPlAl在肝中表达量极低，各给药组对CYPlAl在肝中表达无明显作用，仅人参—藜芦组中一个样品CYPlAl出现了明显表达。对CYP2E1mRNA的调控作用中，人参组CYP2E1mRNA表达量较空白组高，但无统计学差异(P0.05)。配伍组中人参—藜