bhk-21细胞

HK－21的经验：吸出培养基，吸得越干净越好，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培养箱消化。是否需要用hanks或pbs之类得缓冲洗细胞并不绝对必要，我都没有洗，感觉应该洗一下更好，但也更麻烦并增加了污染得可能性。如果细胞长得太老，可以先加入1ml胰酶在细胞表面浸润一下就吸出来，然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前最好预热到37度。由于胰酶平时保存在4度，反复预热对胰酶的活性不好，我的经验是将胰酶进行分装，尽可能避免胰酶反复冷却加热。消化时间的选择要根据实际情况决定，BHK－21还是比较好消化的，5－15min应该足够了，消化时间太长对细胞不利。可以在显微镜下观察消化情况，必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散，消化结束后直接加入培养基即可，胰酶会被血亲灭活。一般在T－25瓶中留7－8ml培养基培养。在90％单层细胞时，1：4传代2天后可长满。如果使用的培养基偏碱最好先放在CO2培养箱中平衡。细胞生长中注意观察培养基颜色（加入酚红作指示剂），如出现偏黄表明细胞代谢产酸较多，此时如细胞未长满应更换部分或全部培养基以确保细胞状态不受影响。1.犬瘟热受体slam基因BHK21表达系建立细胞培养（1）BHK-21细胞复苏从液氮罐中快速取出冻存的BHK-21细胞，浸入37℃的恒温水浴箱内快速摇晃使细胞在60s内完全融化;在超净台内用酒精棉球擦拭冻存管封口处及冻存管，打开盖，轻轻吹打细胞悬浮，吸出细胞悬液装入离心管中，补加培养液至10ml,1000r/min低速离心10min;先用无菌吸管吸取5ml含有10%FBSDMEM培养基至无菌25cmz培养瓶内备用，弃去离心管中上清后加入2ml含有10%FBSDMEM培养基轻轻吹打，混匀后将细胞移入培养瓶中，轻轻反复吹打使细胞在培养瓶中混匀，将培养瓶置于含37℃、5%的CO:细胞培养箱中孵育，次日换液去除DMSO，继续培养。C2)BHK-21细胞传代待BHK-21细胞生长至汇合度为80%以上时，吸弃培养液，加入1ml0.25%的胰酶，轻轻晃动使0.25%的胰蛋白酶均匀覆盖培养瓶，置于CO:细胞培养箱中孵育1}3min，显微镜下观察细胞收缩变圆后立即吸弃胰酶液，加入3ml含有10%FBSDMEM培养基，用无菌吸管将细胞吹打均匀;细胞吹打均匀后1传2进行分瓶，5%COz孵箱37℃培养。C3)BHK-21细胞冻存细胞生长至汇合度为80%}90%时，用0.01mol/LPBSCpH7.2)溶液清洗细胞2次;将细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，吸弃胰酶，加入3ml含有10%FBSDMEM培养基，用无菌吸管将细胞吹打混匀，移入离心管中，补加培养液至10ml,1000r/min低速离心10min,移弃上清，加入细胞冻存液(10%DMSO+90%FBS，吹打混匀后，将细胞悬浮液移入消毒灭菌好的冻存管中，封口膜封口，做好标记;将冻存管放于4℃冰箱中30min，一20℃放置30min，一70℃16-18h，液氮罐保存。