biologyexperimnet期中整理试题及答案1

一．PaulZhou:Whatuniquefeaturesindendriticcellsmakethemthemostpotentantigen-presentingcells.Andhowtoexplorethesefeaturesinvaccinedesignanddevelopment.答：错误!未找到引用源。DCs的特点：DCs广泛分布于全身各脏器，成熟DCs形态特殊，细胞膜具有很强的伸缩能力；DCs的细胞表面标志较多，但缺乏特异性的表面标志.未成熟的DCs具有很强的抗原摄取能力。而成熟的DCs抗原摄取能力下降，处理和提呈抗原的能力提高。成熟DCs的主要特征：细胞形态不规则，表面有许多膜样或树突样突起；细胞表面具有丰富的有助于抗原提呈的分子；在混合淋巴细胞反应中，既能激活MHC相同的自身反应型T细胞，也能激活MHC不同的同种反应型T细胞；能激活NaiveT细胞增殖并建立初级免疫应答，并具有向局部淋巴细胞T细胞区迁移的能力；DCs激发T细胞增殖及抗原提呈能力是巨噬细胞和B细胞的100-1000倍，也是唯一可以激活静息T细胞的APC。正是以上能力使得DCs成为抗原提呈能力最强的APC错误!未找到引用源。DCs在疫苗开发中的应用DCs可以有效递呈来自凋亡细胞的抗原，刺激CTLs成熟，因此可以用于制备抗肿瘤的细胞疫苗、多肽疫苗、以及全肿瘤疫苗。细胞DC疫苗包括凋亡肿瘤细胞致敏的DCs和坏死肿瘤细胞致敏的DCs；多肽DC疫苗则是用已知肿瘤相关抗原肽体外免疫DCs，DC，可诱导相应的特异免疫应答，而且通过修饰某些抗原肽锚位上的单个氨基酸还可以增强该抗原肽与MHCI类分子的亲和力，从而增强其诱导CTL反应的能力；另外，如果利用全肿瘤抗原替代已知抗原疫苗，可以避免鉴定肿瘤特异性抗原的困难，也无需知道患者的MHC类型，还可以降低疫苗的免疫原性。制备全肿瘤型DC疫苗的方法包括有：DC与肿瘤细胞共培养、肿瘤细胞RNA转染DCs、肿瘤-DC融合细胞等等，其中肿瘤-DC融合细胞不但提供DC的抗原呈递功能，还能持续提供内源性肿瘤抗原以进入MHCI呈递途径。二．FACS流式细胞术的特点是什么？可应用在哪些领域？流式细胞的图谱如何识别？答：FACS的特点：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术应用领域包括：错误!未找到引用源。免疫表型分析的应用1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态。淋巴细胞是机体免疫系统功能最重要的大细胞群，在免疫应答过程中，末梢血淋巴细胞发育分化成为功能不同的亚群。当亚群的数量和功能发生异常时，就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化。FACS可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开来，并计算出它们相互间的比例，通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，并指导治疗。2.白血病/淋巴瘤免疫分型；3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系；4.干祖细胞的定量及成分分析；5.粘附分子;TCR多态性检测;肿瘤癌基因及抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶;耐药蛋白的分析等等6.疾病诊断:为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据；7.免疫调节：细胞因子/受体的相互作用、共刺激分子受体/配体的相互作用；8.发病机理：肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递障碍有关；9.药物/疫苗效果的评价：肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果的监测10.免疫状态评价：移植、放化疗等。错误!未找到引用源。DNA含量及细胞周期分析细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M。应用于肿瘤的早期诊断、肿瘤的良恶性判断、观察细胞的增殖状态及周期分布和疗效监测。错误!未找到引用源。定量分析1.检测细胞特异性标记物：FCM不但可以定性分析标记物，而且可以进行定量。用标记已知数量的荧光素分子的标准微球作参照，可以计算出每个细胞抗原定簇的个数；2.CD4绝对计数；3.CD34绝对计数；4.可溶性物质(如细胞因子)的高通量定量检测。错误!未找到引用源。细胞功能分析1.吞噬功能试验；2.氧爆发试验；3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液免疫的II型细胞；4.药物泵的功能检测；5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测；6.血小板的粘附,聚集功能检测。错误!未找到引用源。细胞凋亡研究1.鉴别凋亡与坏死；2.测定凋亡率；3.研究凋亡触发机制。错误!未找到引用源。细胞分选可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上。错误!未找到引用源。其它1.微生物快速鉴定及药敏；2.分子流式细胞术，利用寡核苷酸为探针，检测端粒酶的长度；3.运用抗体进行血小板抗原基因型分型;4.利用GFP或YFP为探针检测基因转染;5.死、活细胞鉴定等等。FACS图谱的识别FACS图谱主要分为单参数分析--直方图（histogram），多参数分析--二维点图（dotplot），二维等高图（contour）和假三维图（pseudo3D）：1．直方图是单参数分析，图形显示一维数据，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横座标可以是线性标度或对数标度，用“道数”（Channel）来表示，即多道脉冲分析器中的道，实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵座标一般表示的是细胞的相对数或细胞出现的频率，而较少使用绝对细胞数。它的局限性是只能显示一个参数与细胞之间的关系。2．二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。在需要研究两个或更多测定量的关系时采用。横座标和纵座标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有两个相应座标值的细胞存在。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是二维点图的信息量要大于二个一维直方图的信息量。3．在二维点图上细胞集中的地方无法表现出细胞在该处是均匀分布还是另有精细结构，为此出现了二维等高图——类似于地图上的等高线表示法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，即细胞数变化快，等高线越疏则表示变化不大。4．假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它在二维空间中作出三维立体图，由于此图中的一维不是参数而是细胞数，即实际上仍为二维图，故称假三维图。它把原二维图中的隐座标—细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节，从而进一步对数据进行分析。若想进一步显示多维数据，如4个参数再加上对应的细胞数，可用列表模式（listmode）技术，它是多参数数据文件的一种计算机存贮方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。还可用ListMode中的特殊技术，开窗（也叫设门）或用游标调出相关部分再改变维数进行显示，如“一调二”（在一维图上用“设门”调出门限范围内的二维图或假三维图）或“二调一”（在二维图上用游标划出范围，调出所划范围的一维图），来找出相关的内容和信息。三．请比较说明三种主要制备人源化抗体方法的优缺点。答：制备人源化抗体的三种方法是：1、嵌合抗体；2、完全人源抗体；3、噬菌体抗体库技术。1、嵌合抗体：利用基因重组技术，把人抗体和鼠抗体的部分结构进行重组，减少鼠源结构，增加人源结构，而保持抗体与抗原的特异性结合。其优缺点主要有以下几点：（1）所有的骨髓瘤都是鼠源的。（2）鼠抗体亦能作为一种抗原，多次反复使用在人体产生抗体及过敏反应（HAMS反应，humanagainstmousesyndrome）。（3）嵌合抗体可保持抗原特异性结合并且外源抗原性降低，但亲和力明显下降。2、完全人源抗体：将编码人抗体Ig重轻链的基因转入小鼠，以替换小鼠的抗体Ig重轻链基因，当这种小鼠用抗原免疫后，产生的抗体就是完全人源化的抗体。其优点是抗体的重轻链都是人源的，在临床应用中不会引起过敏反应。缺点有以下几点：（1）转基因小鼠造价高，保种困难。尚无法商业化；（2）由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单抗具有鼠糖基化模式，所以这些单抗最终并不是全人的；（3）转基因小鼠表达的人Ig多样性较少，而且在同一小鼠中不能够产生IgG各亚类。3、噬菌体抗体库技术：把人的Ig重轻链可变区基因片段展示在噬菌体表面,组成抗体库，然后用抗原从抗体库中筛选特异性抗体。这种方法的优点是通过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶联，易进行分子克隆和基因操作。其缺点有：（1）抗体库的来源影响筛选结果（正常个体和经过免疫的个体）；（2）能高通量地筛选与抗原结合的抗体，但是亲和力较低。四．通常情况下，原代细胞比细胞系难以进行基因转染，原因是什麽？以原代培养的神经细胞为例，列举三种你认为最有效的原代细胞基因转染的方法，并说明其原理以及各自的优缺点。答：原代细胞比细胞系难转染主要是由于原代细胞的分化程度比较高，分裂速度慢，体外分离得到的原代细胞活性远比细胞系的活性低，而细胞系一般是转化的细胞，具有较强的分裂能力和较高的活力，因此，细胞系比原代细胞更易于转染。对于神经细胞，下列三种方法我认为能够有效地对原代细胞进行转染：（1）电穿孔方法：电穿孔方法的原理主要是利用控制的电流脉冲，使活细胞的细胞膜产生孔道，该孔道是暂时的、可逆的。形成的孔道容许大分子物质，如：DNA、蛋白质、染料或代谢物进入细胞。其优点主要有：（a）转染效率高；（b）转染速度快，转染后在很快的时间内就可以有蛋白表达；（c）操作方便简单；这种方法的缺点是需要特殊的电转仪，对设备的要求较高，成本较高。（2）腺相关病毒方法：腺相关病毒转染方法的原理是以病毒为载体通过病毒膜糖蛋白与宿主细胞表面受体相互作用将病毒携带的遗传物质释放到细胞内的方法。其优点有：（a）腺相关病毒能够侵染处于分裂期和非分裂期的细胞；（b）没有病原性，不能引起炎症反应和免疫反应；（c）能够将基因整合到细胞的基因组中；（d）能够稳定长时期表达。主要缺点有：（a）插入的最大片段为5kb；（b）能引起插入突变；（c）很难大量转染，能杀死细胞；（d）存在产生能自我复制的病毒的危险。（3）脂质体法脂质体转染方法是通过带正电荷的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，再与膜上带负电荷的唾液酸相互作用，或者通过细胞的内吞作用使核酸进入细胞。其优点有：可以稳定转染和瞬时转染所有细胞，使用方法简单,可携带大片段DNA,通用于各种类型的裸露DNA或RNA,能转染各种类型的细胞,没有免疫原性，安全，不含病毒成分。它的缺点有：（a）在体内实验中，能引起炎症反应，对机体毒性较大；（b）转染效率较低；（c）外源基因不能整合到细胞基因组中。五．结合具体课题，描述一种细胞转染过程（包括实验目的，细胞类型，转染方法和结果检测手段）。实验目的：研究蛋白A和蛋白B的相互作用细胞类型：COS－7转染试剂：Polyfect（Roche）转染方法：1．各取1ug的pCDNA3-A以及pCDNA3-B至1.5mlEP管；2．加入100ul无抗生素无血清的DMEM，再加入20mlPolyfect，振荡3－5次，室温静置5－10min；3．移走细胞培养液，再分别加入2ml新鲜培养液；4．往EP管中再加入600ul有抗生素血清的DMEM，混匀后加入至6孔板中，充分摇匀，置37℃孵箱。结果检测：coIP1.对于转染的六孔板，一个孔设置阴性，一个孔为anti－mo