CGI-58实验方案

实验方案1.CGI-58基因的克隆1.1总RNA提取用TRNzol-A+((天根生化科技有限公司)提取乌金猪背最长肌的总RNA，RNA储存在-80℃冰箱中待用。1.2反转录根据所测RNA的浓度，取2μg总RNA,用反转录试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）进行反转录，操作方法严格按照试剂盒说明书执行，。反转录后的cDNA于-20℃保存。1.3PCR根据GenBank上猪的CGI-58基因序列，登录号为AY902463.1，用Primer5软件设计目的基因，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，目的片段1050bp。引物：上引：ATGGCAGCAGAGGAGGAGGA下引：TCAGTCCACAGTGTCACAGAPCR反应体系为25μL：模板cDNA：1μL、上游引物和下游引物各1μL（引物浓度为10μM）,、Buffer:2.5μL、dNTP:2μL、酶：0.25μL、水：17.25μL。PCR反应条件：预变性94℃3min变性94℃30s退火68℃30s35循环延伸72℃1min后延伸72℃10min1.4连接与转化酶连体系（10μl体系）：pMD18-T1μl（PCR仪中16℃90min）DNA胶回收产物4μlSolutionⅠ5μl（冰上融解）1.5转化把重组质粒转化到大肠杆菌受体细胞中，具体步骤如下：1)取50μl稍混匀后的感受态细胞悬液（冰上解化冻30min后进行下述操作）。2)加入上述10μl重组质粒DNA连接溶液（含量不超过50ng），轻轻摇匀。3)42℃水浴热激45-90s（热激期间不要摇动离心管），后马上转移至冰上，放置1分钟。4)然后向管中加入37℃预热的940μl的LB液体培养基，混匀。5)37℃培养1小时，使细胞恢复正常生长状态。6000rpm离心4min，倒掉多于液体（剩100-200μl）。6)将菌液涂布于LB固体培养基上，37℃过夜培养12h。4℃放置3h以上。1.6挑菌50ml管内加10mlLB液体培养基（加入10μlAmp），用白枪头挑菌，每个挑10管。1.7保种甘油0.8ml和0.8ml的菌液，送一管测序，其余-80度保存。1.8质粒DNA的提取1).取过夜培养的2m1菌液，8000g离心2分钟，彻底去除上清。2).加入250μlBufferPI，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。3).加入250μlBufferPII，温和上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。4).加入350μlBufferPIII，温和上下颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。5).12000g，离心10分钟，上清液移入吸附柱。6).8000g离心30s，倒掉收集管液体，加入500μlBufferDW1，9000g离心30s，倒掉收集管液体。7).加入500μlWashSolution，9000g离心30s，倒掉收集管液体。8).重复步骤7一次。9).空吸附柱9000g离心1分钟。10).将吸附柱放入干净的1.5m1的离心管中，在膜中央加50-100μlElutionSolution，室温下放置1分钟，离心1分钟。11).洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或‐20℃保存备用。1.9限制性内切酶消化（双酶切）EcoRⅠ:1μlHindⅢ:1μl10*M:2μl37°2小时DdH2O:8μl质粒DNA:8μl2.CGI-58基因表达载体的构建2.1菌液活化试验对CGI-58测序正确的保存菌液进行活化，将100μL菌液接种于10mlLB(含Amp)液体培养基进行培养；37℃，220rpm震荡培养12-14h。2.2表达载体菌液活化试验图1pIRES2-AcGFP1载体Figure1pIRES2-AcGFP1vector将10μLKana与100μL活化后的载体菌液接种于10mlLB液体培养基，37℃，220rpm震荡培养12-14h。2.3质粒提取将CGI-58与表达载体的活化菌液均按以下操作提取质粒：（1）取1.5-5ml菌液，于室温8000×g离心2min收集菌体，倒尽或吸干培养基。（2）在菌体沉淀中加入250lBufferP1.，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。（3）加入250lBufferP2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min。（4）加入350lBufferP3，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。（5）12000×g离心5-10min，将上清夜全部移入吸附柱，8000×g离心30s.倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。（6）在吸附柱中加入500μL去蛋向液BufferDW1,9000×离心30s，倒掉收集中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（7）向吸附柱中加入500μLWashsolution，9000×g离心30s，倒掉收集管中体。（8）重复步骤7一次。（9）将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心1min。（10）将吸附柱放入一个干净的1.5离心管中，在吸附膜中央加入50-100μLElutionBuffer，室温静置1-2min，10000×g离心1min。将所得的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。2.4酶切酶切体系：质粒DNA:8μL，EcorⅠ:1μL，HindⅢ:1μL，BufferM:2μL，加水至总体积20μL，混匀，37℃酶切2.5h，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。2.5质粒PCR试验根据基因数据库CGI-58序列，应用primerpremier5.0软件设计针对CGI-58特异性引物，分别在引物两端加入EcoRI和PstI两个限制性酶切位点（下划线部分），在上游引物起始密码子后加入His标签（斜体绿色部分），用于后续蛋白水平检测。上引：5’-GGAATTCCGCCACCATGATCATCACCATCACCATC-GCAGCAGAGGAGGAGGA-3’下引：5’-AACTGCAGAACCAATGCATTGGTCAGTCCACAGTGTCACAGA-3’以克隆并测序正确的CGI-58质粒DNA为模板，采用PCR技术扩增功能基因片断；PCR反应体系：质粒DNA:2μL，dNTPs:2μL，上下游引物均为1μL，10×buffer:2.5μL，H2O:16.25μL，TransTap:0.25μL。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s、65℃30s、72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。2.6质粒PCR产物胶回收采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根公司）进行PCR产物的回收。经2.0%琼脂糖凝胶电泳后，按如下步骤进行：（1）准备工作：检查Washsolution中是否已经加入乙醇；检查BufferP2是否出现沉淀。将水浴锅调至50℃。（2）从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重。（3）加入胶块重量3-6倍的BufferP2，50℃水浴5-10分钟溶胶。（4）将溶胶液移入吸附柱中，8000×g离心30s，倒掉收集管中液体。（5）加入500μLWashsolution,9000×g离心30s,倒掉收集管中液体。（6）重复步骤（5）一次。（7）空吸附柱于9000×g离心1min。（8）将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40μLElutionBuffer，室温静置1min，离心1min，保存管中DNA溶液。2.7酶切酶切体系：CGI-58(胶回收)DNA:8μL，EcoRI:1μL，PstI:1μL，10×Buffer:2μL，加水至总体积20μL，混匀；pIRES2-AcGFP1:20μL，EcoRI:2.5μL，PstI：2.5μL，10×Buffer：5μL，加水至总体积50μL。2.8酶切产物胶回收操作步骤同2.62.9酶切胶回收产物与载体的连接及连接产物的转化（1）配制10μL连接体系：酶切胶回收产物6.5μL；Vector（pIRES2-AcGFP1）1.5μL；T4连接Buffer：1μL；T4连接酶：1μL。（2）连接条件：16℃过夜连接，12-14h。（3）全量10μL加入至50μLDH5α感受态细胞中，冰上放置30min。（4）42℃热击45s，冰上放置1min。（5）加入890μLLB培养基，37℃振荡培养60min。（6）8000rpm离心3min，把管内液体吸走一部分，把剩余的液体吹打均匀后加入到LB固体培养基(kana)中涂布均匀。将平板置于37℃培养至液体被吸收，倒置平板于37℃培养12-16h，可出现菌落。（7）用灭菌牙签挑取单个转化菌落，接种于10mlLB(10μLkana)液体培养基中，37℃，250r/min振荡培养12-16h。2.10pIRES2-AcGFP1-CGI-58质粒提取操作步骤同2.1.32.11酶切鉴定阳性重组质粒酶切体系20.0μL：pIRES2-AcGFP1-CGI-58质粒：2.0μL，10×bufferK:2.0μL，EcoRI:0.5μL，PstI：0.5μL，ddH2O15.0μL。于37℃水浴反应2～3h后，琼脂糖凝胶电泳鉴定。33T3-L1细胞瞬时转染3.1细胞培养3T3-L1细胞培养基为90%DMEM+10%小牛血清(NBS)+1%双抗，37℃，5%CO2恒温培养箱培养。细胞复苏之后，在25cm2方瓶中传代培养。在每个培养瓶中加入10ml配制好的10%胎牛血清完全培养基，然后放入CO2浓度为5%的细胞培养箱内培养。每天定时在显微镜下观察3T3-L1细胞的形态，并照相。每2d换一次培养液，细胞密度达到80%-90%时可进行细胞传代。3.2质粒准备用测序正确的表达载体进行质粒提取，提取方法同2.3，提取后酶切鉴定，酶切体系和条件同2.11，然后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定（质粒测定A260／A280，比例在1.80至1.95之间方可使用，同时测定质粒浓度）。3.3瞬时转染转染前一天，胰酶消化细胞并计数,将消化的细胞在6孔培养板中，使其在大约24小时后转染前密度达到80%。根据本实验室前期研究优化的转染条件，转染时分空白组，对照组和实验组。实验组采用pIRES2-AcGFP1-CGI-58重组质粒和Lipofectamine2000脂质体试剂盒，并按其推荐的质粒：脂质体=4g/10ul，以80%细胞融合度进行转染，转染时间4h，在转染结束后18h，采用荧光显微镜摄影，观察转染情况；以未转染的3T3-L1细胞作为空白组；以转染空载体pIRES2-AcGFP1的3T3-L1细胞作为对照组，每组3个重复。具体操作过程如下：(1)配制溶液A：使用50μLOpti-mem无血清培养基稀释适量质粒，轻轻混匀后于室温放置5min。(2)配制溶液B:使用50μLOpti-mem无血清培养基按转染方案稀释适量Lipofectamine2000试剂。轻轻混匀后于室温放置5min。(3)将步骤2和步骤3的溶液对应混合，轻轻混匀后于室温静置20min。(4)同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗2遍后，加入0.5ml无血清培养基，转染时再吸弃。(5)将步骤3的复合物按转染方案对应加入到每孔中，加入500μLOpti-mem,摇动培养板，轻轻混匀。置于37℃，5%CO2培养箱中培养4h。(6)4h后，将无血清培养基更换为含有血清的培养基（不含双抗），继续孵育18小时于荧光显微镜下检测结果。4油红O染色提取法检测甘油三酯沉积油红O染色提取法分析甘油三酯沉积量,具体方法为:取出培养板,弃培养液,PBS冲洗后,细胞用10%甲醛固定30min,PBS冲洗3次,后用油红O工作液染色30min.移去染色液,清水彻底冲洗.加入异丙醇提取结合到脂滴的染料,在510nm波长处比色,记录吸光度值.每组实验重复3次.5.CGI-58的mRNA和蛋白表达情况的检测5.1采用荧光定量PCR技术检测CGI-58的mRNA表达情况；收集转染的细胞，用无双抗的PBS冲洗2遍，加1mlTrizol裂解液到培养皿，室温放置15min，收集细胞，提取细胞总RNA。PCR